小檗堿調(diào)控內(nèi)質網(wǎng)應激水平影響UC結腸炎癥反應的實驗研究

沈雁 王章流 鄭華君 鐘繼紅 江向紅 倪思憶 李思

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種以黏膜炎癥和潰瘍形成為主要病理特征的慢性結腸炎癥性疾病，常反復發(fā)作、遷延不愈，是目前消化科難治性疾病之一[1-2]。近年來，我國UC發(fā)病率不斷上升，且患者多為青壯年[3]。研究表明，腸上皮細胞（intestinal epithelial cells，IECs）異常凋亡導致的腸黏膜屏障損傷是造成UC結腸炎癥反應持續(xù)存在的主要原因，而內(nèi)質網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）狀態(tài)下激活的 Caspase-12/Caspase-3凋亡信號轉導通路可能起到重要的中介作用[4-6]。小檗堿（berberine，BBR）是中藥黃連中提取的有效活性成分，對于多種急慢性炎癥均有良好的抑制作用，其用于治療UC效果確切[7-8]。基于此，本研究從Caspase-12/Caspase-3信號轉導通路角度出發(fā)，探討B(tài)BR是否通過調(diào)控ERS水平來影響IECs凋亡行為，以起到治療UC的作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性SPF級BALB/c小鼠60只，8 周齡，體重（20±2）g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號為SCXK（滬）2017-0005，合格證號為0345203。實驗動物房使用許可證號為SYXK（浙）2015-0008，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度 20～25℃，相對濕度 40%～70%。

1.1.2 藥品與試劑 右旋葡聚糖硫酸酯鈉（DSS，美國MP Biomedicals公司，批號：BJ14745）；小檗堿（BBR，上海源葉生物科技有限公司，批號：Y18D8C50814）；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 78（GRP78）、Caspase-12 和 Caspase-3 一抗（英國Abcam公司，批號分別為GR309483-1、ab62484和ab13847）；抗兔和抗鼠二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號分別為K167722B、K175212C）；蛋白酶K（北京 Tiangen公司，批號：M2011）；DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：K167722A）；TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒（德國ROCHE公司，批號：11906800）；高純總RNA快速提取試劑盒（上海Generay公司，批號：1703G01）；逆轉錄試劑盒HiScript-II Q RT SuperMix for qPCR（南京 Vazyme公司，批號：7E092G6）；qPCR試劑ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix（南京Vazyme公司，批號：7E092H6）。

1.1.3 儀器 RM2235型輪轉式切片機（德國LEICA公司），Tec 2500型病理組織漂烘儀（常州市郝思琳儀器設備有限公司），BX43型顯微鏡（日本OLYMPUS公司），PYX-DHS500BS-Ⅱ型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械有限公司），BCD-211KD3型冰箱（TCL公司），C21-SDHC15K型電磁爐（浙江紹興蘇泊爾生活電器有限公司），101-3型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海錦屏儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組及處理 將60只小鼠按隨機數(shù)字表法分為空白對照組、模型對照組、BBR低劑量組（UC模型+100mg·kg-1BBR）、BBR 中劑量組（UC 模型+150mg·kg-1BBR）和 BBR 高劑量組（UC 模型+200mg·kg-1BBR），每組12只。按人-小鼠體表面積換算，分別用蒸餾水配制成低、中、高劑量的BBR混懸液。采用DSS誘導法建立UC模型：配制5%DSS溶液（5g DSS溶于100ml蒸餾水中），空白對照組小鼠每日自由飲用蒸餾水（100ml），其他各組小鼠自由飲用5%DSS溶液，連續(xù)7d。BBR低劑量組、中劑量組和高劑量組小鼠造模同時予BBR混懸液灌胃（給藥容量為10ml·kg-1），模型對照組和空白對照組小鼠給予等體積蒸餾水，1次/d，共7d。

1.2.2 指標觀察檢測

1.2.2.1 一般情況觀察 自造模之日起，每日觀察并記錄各組小鼠的精神活動狀態(tài)、攝食量和飲水量等情況，每日定時稱量體重，觀察糞便性狀并行隱血試驗與疾病活動度評分（disease activity index，DAI）。DAI=（體重減輕率分數(shù)+大便性狀分數(shù)+隱血程度分數(shù)）/3。

1.2.2.2 結腸組織病理學檢測 用藥結束后，全部小鼠以頸部脫臼法處死，嚴格無菌條件下取出結腸組織，肉眼觀察黏膜與漿膜面的變化。取新鮮結腸組織1塊，修整大小為1.0cm×1.0cm×0.2cm，置于包埋盒用4%多聚甲醛固定4d，石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，HE染色后光鏡下觀察組織病理學變化。

1.2.2.3 結腸組織IECs凋亡情況檢測 結腸組織切塊后用4%多聚甲醛固定，包埋切片，按照TUNEL試劑盒說明書進行操作。主要步驟如下：切片脫蠟入水，蛋白酶K工作液37℃消化組織20min，PBS沖洗，加TUNEL反應混合液（含5μl TdT和45μl熒光素標記的dUTP標記液），加封閉液于暗濕盒中37℃反應30min，漂洗，加DAB底物，顯微鏡下控制顯色，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明中性樹膠封片。TUNEL陽性細胞呈褐色或深褐色，正常結腸上皮細胞呈藍色。每張切片于400倍鏡下隨機選取5個視野觀察，記錄并統(tǒng)計TUNEL陽性細胞數(shù)，即代表IECs凋亡數(shù)。

1.2.2.4 免疫組化法檢測結腸組織GRP78、Caspase-12和Caspase-3蛋白的表達 結腸組織切塊后用4%多聚甲醛固定，包埋切片，按照免疫組化染色法進行操作。主要步驟如下：切片二甲苯脫蠟，梯度酒精復水，3%過氧化氫溶液37℃孵育15min，PBS沖洗，滴加一抗4℃冰箱孵育過夜，滴加二抗37℃孵育30min，DAB反應染色，顯微鏡下觀察反應進度，沖洗、復染，干燥，封片。每張切片于200倍鏡下隨機選取3個視野觀察，判讀陽性表達強度和陽性率。參照Fromowitz法進行評分，具體評分標準：（1）染色強度（以多數(shù)細胞呈現(xiàn)的染色強度并減去背景著色計分）：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；（2）陽性范圍：＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。計算兩項結果之和，＜2分為陰性（-），2～3分為弱陽性（＋），4～5分為中度陽性（＋＋），6～7 分為強陽性（＋＋＋）；以評分代表蛋白表達水平。

1.2.2.5 熒光定量PCR法檢測結腸組織GRP78 mRNA的表達 Trizol-離心柱法提取結腸組織總RNA，測定總RNA純度和含量后按照試劑盒說明書進行逆轉錄合成cDNA。PCR 體系（20μl）：10.0μl ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix，上下游引物（10μmol/L）各 0.6μl，8.8μl cDNA。PCR 反應條件 ：95℃ 30s；40 個循 環(huán)（95℃ 10s，60℃30s，收集熒光）。PCR 引物序列與擴增條件詳見表1。取PCR產(chǎn)物用l%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)成像，目標mRNA的表達采用內(nèi)參Musβ-Actin進行校正，基因相對表達水平以 2（Ct內(nèi)參基因-Ct目的基因）表示。

表1 PCR引物序列與擴增條件

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件；計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 5組小鼠一般情況比較 造模成功后，模型對照組與BBR低、中、高劑量組小鼠均出現(xiàn)不同程度的精神呆滯、行動緩慢、進食少，伴有大便稀溏、便血、體重下降，而空白對照組小鼠的精神、活動、飲食、大便、體重等一般情況均正常。5組小鼠DAI比較見表2。

由表2可見，5組小鼠DAI比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；模型對照組與BBR低、中、高劑量組小鼠DAI均高于空白對照組（均P＜0.05）；BBR高劑量組小鼠DAI較模型對照組降低（P＜0.05），而BBR低、中劑量組小鼠DAI與模型對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

表2 5組小鼠DAI比較（分）

2.2 5組小鼠結腸組織病理學變化比較 見圖1。

圖1 5組小鼠結腸組織病理學變化比較

由圖1可見，空白對照組結腸組織結構正常，黏膜上皮未見病變；模型對照組結腸可見黏膜下隱窩腺體全部丟失，炎癥細胞浸潤黏膜至上皮結構破壞；BBR低、中、高劑量組中，以BBR高劑量組結腸組織結構與正常對照組最為接近，BBR低劑量組可見隱窩腺體大片丟失，黏膜下炎癥細胞浸潤，部分黏膜上皮可見水腫，BBR中劑量組與低劑量組相比病變程度有所減輕。

2.3 5組小鼠結腸組織IECs凋亡情況比較 見圖2、表3。

圖2 5組小鼠結腸組織IECs凋亡情況比較

表3 5組小鼠結腸組織IECs凋亡數(shù)（個/5個視野）

由表3可見，5組小鼠結腸組織IECs凋亡數(shù)比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；模型對照組與BBR低、中、高劑量組小鼠結腸組織IECs凋亡數(shù)均高于空白對照組（均P＜0.05）；BBR低、中、高劑量組小鼠結腸組織IECs凋亡數(shù)均較模型對照組減少（均P＜0.05）。

2.4 5組小鼠結腸組織 GRP78、Caspase-12和 Caspase-3蛋白表達水平比較 見圖3、表4。

由圖3可見，GRP78、Caspase-12和Caspase-3陽性細胞均呈褐色或黃褐色，上述蛋白主要表達于細胞質。由表4可見，5組小鼠結腸組織GRP78、Caspase-12和Caspase-3蛋白表達水平比較均有統(tǒng)計學差異（均P＜0.05）；模型對照組小鼠結腸組織GRP78、Caspase-12和Caspase-3蛋白表達水平均高于空白對照組（均P＜0.05）；BBR中、高劑量組小鼠結腸組織GRP78、Caspase-3表達水平均低于模型對照組（均P＜0.05），BBR高劑量組Caspase-12表達水平低于模型對照組（P＜0.05）。2.5 5組小鼠結腸組織GRP78 mRNA表達水平比較 見表5。

圖3 5組小鼠結腸組織GRP78、Caspase-12和Caspase-3蛋白表達水平比較

由表5可見，5組小鼠結腸組織GRP78 mRNA表達水平比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；模型對照組與BBR低、中、高劑量組小鼠結腸組織GRP78 mRNA表達水平均高于空白對照組（均P＜0.05）；BBR中、高劑量組小鼠結腸組織GRP78mRNA表達水平均較模型對照組降低（均 P＜0.05）。

表4 5組小鼠結腸組織GRP78、Caspase-12和Caspase-3蛋白表達水平比較（分）

表5 5組小鼠結腸組織GRP78 mRNA表達水平比較

3 討論

ERS是真核細胞中普遍存在且高度保守的應激反應機制，是指細胞在各種應激原的刺激下，其內(nèi)質網(wǎng)合成加工蛋白質的生理功能發(fā)生障礙，大量未折疊或錯誤折疊蛋白在內(nèi)質網(wǎng)腔中蓄積所啟動的一系列細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡過程[9]。ERS在決定應激細胞的結局如抵抗、適應、損傷或凋亡中發(fā)揮重要作用。定位于內(nèi)質網(wǎng)膜上的GRP78通常被認為是ERS的標志性分子，其表達水平代表了細胞的應激水平。生理條件下，GRP78與內(nèi)質網(wǎng)跨膜感受蛋白相結合而使后者處于無活性狀態(tài)。當細胞ERS適度時，跨膜感受蛋白與GRP78發(fā)生解離而活化，進而通過未折疊蛋白反應（UPR）的保護性機制以改善應激細胞內(nèi)蛋白質的合成加工，恢復和維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，避免細胞損傷。但若ERS程度過強或持續(xù)過久，UPR不足以完全代償緩解細胞損傷時，為維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，活化的跨膜感受蛋白將進一步激活細胞凋亡程序，誘導應激細胞的程序性死亡[10-11]。Caspase-12是ERS特異性凋亡信號轉導通路的起始因子，它僅在ERS狀態(tài)下被激活并進一步磷酸化激活下游的凋亡執(zhí)行因子Caspase-3，從而獨立地介導細胞凋亡[12-13]。

IECs是一種ERS活躍細胞，其在生理條件下發(fā)生的適度凋亡與腸道干細胞的分化補充間維持動態(tài)平衡[14]；但當其受到腸腔內(nèi)病原微生物、黏膜炎性介質、缺血缺氧等應激原的刺激后易發(fā)生過度的ERS，出現(xiàn)凋亡加速，導致腸黏膜屏障損傷，腸上皮通透性增高[15]，各種內(nèi)外源性抗原物質異常暴露并激活腸道局部免疫系統(tǒng)，通過瀑布樣級聯(lián)放大的連鎖免疫炎癥反應，引起組織損傷。研究表明，UC患者和動物模型的IECs中可檢測出ERS過度狀態(tài)[16-18]；而不同應激原刺激IECs所構建的體外ERS模型以及UC患者、動物模型的結腸組織中亦普遍存在細胞異常凋亡現(xiàn)象[19-23]。因此，IECs在ERS狀態(tài)下過度凋亡是導致腸黏膜屏障損傷、引起UC發(fā)生發(fā)展的重要病理機制[4-6]，通過抑制應激特有的Caspase-12/Caspase-3凋亡信號通路活化而抑制IECs的凋亡是治療UC的可能有效方法之一。

BBR是從黃連中提取的一種異喹啉類生物堿，具有較強的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，BBR對UC具有良好的治療效果，可能通過調(diào)整腸道菌群結構[24]、保護腸屏障功能[25]和調(diào)節(jié)免疫應答反應[26]等機制發(fā)揮作用，但直接研究BBR調(diào)控ERS影響IECs凋亡水平，從而介導UC結腸炎癥反應發(fā)生、發(fā)展方面的報道較為少見，有必要就此深入研究。本研究結果表明，BBR治療能明顯緩解UC小鼠腹瀉、便血、體重減輕等臨床癥狀，明顯減輕結腸黏膜炎癥細胞浸潤、上皮水腫、上皮結構破壞及隱窩腺體丟失等結腸組織病理學損傷，UC小鼠的DAI均明顯下降，說明BBR治療UC具有良好的臨床效果。與正常小鼠相比，UC小鼠發(fā)生凋亡的IECs顯著增多，經(jīng)各劑量的BBR治療后，細胞的凋亡水平均較模型對照組明顯減輕，說明IECs凋亡過度是UC的重要病理過程之一，而BBR能有效抑制IECs的凋亡行為。GRP78、Caspase-12和Caspase-3蛋白主要存在于細胞質中，與正常小鼠相比，3者在UC小鼠結腸組織中的表達水平均顯著升高，GRP78 mRNA的相對表達量亦升高；而經(jīng)中、高劑量的BBR治療后，上述3種蛋白和GRP78 mRNA的表達水平均較模型對照組明顯下降，提示ERS介導的Caspase-12/Caspase-3凋亡信號通路參與了UC小鼠IECs凋亡過程。

綜上所述，BBR減輕UC結腸炎癥可能與下調(diào)ERS水平，抑制ERS介導的Caspase-12/Caspase-3凋亡信號通路有關。本研究結果有助于進一步闡明BBR治療UC的作用機制，BBR在UC治療方面的應用前景值得期待。