應用PCR技術檢測低氧小鼠BDNF基因效果探析

吳曉東，楊 錦，郝云蘭，高曉宇，謝 偉，侯 林，崔海紅，張芳芳

（1.包頭醫學 院基礎學院；2.包頭醫學院 麻醉學院；3.包頭醫學院 公共衛生學院，內蒙古 包頭 014040；4.內蒙古民族大學 動物科學技術學院，內蒙古 通遼 028000；5.泰山醫學院藥理學研究所，山東 泰安 271016）

1 引言

多聚酶鏈式反應技術（Polymerase Chain Reaction,PCR）是一種體外擴增合成特異性DNA片段的方法[1]，擴增過程包括變性、退火以及延伸等反應，在經多次循環反應后，使得目的基因片段得以快速擴增,其具有靈敏度好、特異性強、操作簡便、迅速等特點.PCR技術不但用于基因序列分析、鑒定、擴增等基礎研究,而且還可用于多種疾病的基因診斷.

低氧是目前臨床醫療中常見的病癥，也是各類致死疾病的主要原因[2].研究表明低氧作用具有雙重性，即急性嚴重的缺氧導致機體損傷，而適度低氧或低氧預適應對機體有益的保護作用.這主要取決于低氧的程度和持續的時間.因此，這種雙重作用和其調節機制也越來越受到關注.而低氧預適應作為機體抵抗缺氧損傷的一種內源性保護機制[3]，當機體經過多次短暫、非致死性的低氧刺激后，神經系統在內的多個組織對低氧損傷的耐受性均有增加，這種機制更傾向于對機體的保護，所以目前該機制還尚未明確.

BDNF是在腦內合成的一種蛋白質[4]，廣泛分布于中樞神經系統內，具有減少神經元損傷和死亡、監視神經元病理狀態以及調控受損神經元分化和再生等生物學功能.研究發現[5]，急性低氧損傷可造成BDNF其信號通路的改變.而低氧預適應的神經保護機制是否涉及BDNF仍未有定論.因此，本文通過PCR技術擴增低氧小鼠的BDNF基因，來研究總結了不同類型低氧即急性低氧和低氧預適應對BDNF的影響以及對BDNF信號通路途徑中發揮的作用，為后續低氧研究特別是為低氧機制研究提供一些要參考.

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 材料及試劑

18g～22g雄性小鼠20只；細胞裂解液，Thermo公司產品；DNA合成引物，生物工程（上海）有限公司；PCR Mixture，北京康為生物技術有限公司；DEPC水；瓊脂糖購自美國；TBE液（MCE公司產品）；苦味酸；其他試劑及器材均由包頭醫學院中心試驗室提供.

2.1.2 儀器設備

超聲波細胞粉碎機（JY98-16）；微量分光光度計（Nondrop2000）； 低 速 離 心 機 （H1208）； 移 液 槍（Thermo，YM16AA0067439）；冷凍離心機 （Thermo701）；混勻儀（MX-H/RL-O）；振蕩器（8HZ-81）；微波爐（HAIER）；PCR 儀（ARKTIK）；電泳儀（BIO RAD，Wide Mini-Sub Cell GT）；全自動凝膠成像系統（Tocan240）等.

2.2 方法

2.2.1 小鼠低氧模型的建立

將實驗雄性小鼠放入250 mL的瓶中，塞緊蓋子，迅速記下起始時間，觀察小鼠的呼吸狀態.當實驗小鼠到達低氧非致死狀態時，即小鼠出現仰呼吸急促，急躁，最后出現痙攣.快速拔下蓋子，快速取出實驗小鼠，記錄缺氧時間，該小鼠為低氧1次，則低氧1次小鼠模型構建成功，實驗結束.繼續重復上述步驟4次，取出小鼠后，記錄4次時間，該小鼠為低氧4次小鼠，則低氧4次小鼠模型構建成功，實驗結束.未低氧直接處死的小鼠記為對照組.小鼠低氧結束后，處死并立即剝離小鼠海馬，放入1.5 mL的EP管中，在-80℃的冰箱中凍存.

2.2.2 PCR反應

2.2.2.1 引物的合成與設計 引物由Invitrogen公司合成，引物基因序列見表1.引物稀釋，5μL上引物加5μL下引物再加90μL dd H2O.

表1 基因引物序列

2.2.2.3 擴增及電泳 擴增，放入ARKTIK PCR儀中，反應條件為預變性溫度 95℃5min；95℃30s，退火溫度 59℃30s，72℃30s共 40 個循環，72℃2min 延伸. 配膠，0.2g～0.4g瓊脂糖凝膠；20ml～40ml TBE液；微波爐加熱至清澈透明；不燙手時加入一點EB液；倒入電泳槽中；插入木梳；凝膠冷卻30min.電泳，拔出木梳并每空加樣4μL，電泳結果見圖3.

3 結果

3.1 基因組DNA的純度與濃度的檢測結果

用微量分光光度計（Nondrop2000）檢測序列基因DNA的純度和濃度結果如圖1和表2所示.顯示所檢測樣品的序列基因DNA紫外吸光值（OD260/280）均在1.80～2.00之間，說明DNA的純度和濃度較好，可用于本試驗操作.

圖1 核酸濃度曲線

表2 DNA的濃度和純度

3.2 重復低氧后可以提高小鼠低氧耐受時間

小鼠缺氧耐受時間隨著低氧次數的增加而雙倍增加，即后4次低氧耐受時間比前1次耐受時間更明顯（*P＜0.05），可見當低氧預適應后小鼠的耐受時間增加了.

圖2 小鼠不同低氧次數的耐受時間記錄

3.3 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果

應用PCR擴增BDNF基因電泳檢測結果見圖 3結果所示：：①低氧一次小鼠組泳道 2，3，4，5，6，7 并且與對照組相比條帶亮度增加了，說明小鼠急性低氧時BDNF基因表達增加了②低氧四次小鼠組泳道 8，9，10，11，12 擴增出BDNF基因并且與對照組相比條帶亮度減少了，說明小鼠低氧預適后BDNF基因表達降低了③急性低氧時小鼠可能通過表達BDNF基因，對其神經損傷起到了修復作用，而隨著小鼠對低氧環境的適應這種保護機制出現了降低趨勢，這有待于我們繼續去研究.

圖3 PCR擴增BDNF基因電泳檢測結果

3 討論

PCR技術具有快速簡便檢測目的基因的效果[6]，本實驗通過PCR擴增結果可知低氧預適應小鼠可能是過表達了BDNF基因，從而對其神經損傷起到了修復作用，而急性低氧小鼠對低氧環境的適應這種修復作用出現了降低趨勢.近期研究也發現[7]，急性低氧與低氧預適應都可能通過調控BDNF的表達，從而影響腦的結構和功能，但是激活下游途徑的機制不同，產生的結果也不相同.當機體缺氧時，BDNF在調節中樞神經系統生存和死亡的過程中發揮著至關重要的作用[8].通過檢測缺氧對BDNF表達的影響時發現，當急性缺氧處理后，其能夠調控BDNF在神經細胞中的表達，進而神經細胞的損傷.Tian的小鼠低氧實驗通過低氧刺激誘導BDNF和TrkB受體的表達也證實了二者在神經系統中發揮著重要作用[9].另外，將神經細胞置于24小時常氧和急性低氧情況下同時培養，BDNF與在急性低氧條件下的結合明顯減少[10].研究還表明，BDNF誘導啟動子的活性增加，可能是啟動了相關缺氧反應元件的突變[11].Scott等研究發現[12]，當BDNF作用于大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞TrkB受體（AMC）時，低氧預適應組、暴露在急性缺氧組和正常對照組三者相比，其AMC的TrkB受體興奮性升高，細胞內BDNF和兒茶酚胺的分泌也明顯增加.TrkB通過與配體BDNF結合，在后期低氧損傷的神經元中發揮著重要調節作用[13].小鼠低氧預適應時可以刺激神經細胞中的BDNF表達上調，這為我們后期的相關機制的研究具有重要的參考價值.

5 結語

近年來，隨著低氧神經保護作用研究的不斷深入，已經逐漸發現了低氧具有雙重作用，既可能產生損傷，又可產生對機體有益的保護作用，這主要取決于低氧的程度和持續的時間，以及激活反應體系不同而論.隨著低氧對BDNF作用機制中的一些新的信號蛋白和信號通路的發現，其機制也越來越受到關注.本文應用PCR技術擴增了低氧小鼠BDNF基因，歸納了腦源性神經營養因子在神經研究方面的最新進展，低氧后對小鼠低氧耐受時間進行了分析.除此之外，還分別對急性低氧和低氧預適應對BDNF的影響和表達進行了更新.然而，到目前為止，低氧損傷與低氧預適應對BDNF及其信號通路的具體影響機制還有待我們進一步探究.