醋炙元胡中延胡索乙素不同提取方法比較

張艷華，包淑云，年四輝，喻麗珍，劉人豪

（皖南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 蕪湖 241002）

元胡為罌粟科紫堇屬植物延胡索(Corydalis yanhusuo W.T.Wang)的塊莖，具有行氣止痛、活血散瘀、治療跌打損傷的功效.用于跌打腫痛、崩中、癥瘕、產(chǎn)后血暈、經(jīng)閉痛經(jīng)、惡露不盡等.其在李時珍的《本草綱目》等本草書籍中都有記載，是常用中藥，內(nèi)含約30種生物堿，主要是原小檗堿類和阿樸啡類生物堿，包括了延胡索甲素、延胡索乙素、小檗堿、黃連堿、元胡寧等，其中最主要的有效成分是延胡索乙素，2015年版《中華人民共和國藥典》對其質(zhì)量控制要求元胡中延胡索乙素含量不得低于0.04%[1]，因延胡索乙素是叔胺堿，易溶于有機溶劑，不易溶于水，在對其進行提取時，一般可利用其脂溶性的特性，直接用有機溶劑提取，也可以使其由叔胺堿轉(zhuǎn)變成易溶于水的季胺堿后用親水性溶劑提取，而臨床上根據(jù)病癥不同，主要有延胡索生用和用醋炮制后使用兩種方法，用得最多的是醋制品.為了使延胡索中的有效成分被充分利用，提高延胡索乙素的提取率，本實驗采用多種提取方法，以延胡索乙素為指標，采用RP-HPLC法測定不同提取方法中延胡索乙素的含量，比較不同提取方法的提取率，為延胡索被更好的利用提供參考.

1 材料與儀器

1.1 材料

元胡藥材（產(chǎn)地為安徽宣城）購自亳州藥材市場，經(jīng)鑒定為罌粟科植物延胡索 (Corydalis yanhusuo W.T.Wang)的干燥塊莖.延胡索乙素標準品（批號110726-201213）購自中國食品藥品檢定研究院，米醋（江蘇恒順醋業(yè)股份有限公司）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水.

1.2 儀器

日本島津LC-20A高效液相色譜儀（SPD-M20A檢測器、LC-20AT真空在線脫氣機、CTO-10AS柱溫箱、LC-20AT四元泵）、KQ5200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、D2F-6050型真空干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）、JY501型電子天平（上海浦春計量儀器有限公司）、電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、PHS-3C精密PH計（上海越平科學(xué)儀器有限公司）.

2 方法

2.1 炮制品的制備[2]

取大小均勻的元胡100g，加入純米醋20g拌勻，待醋液吸盡后，燜潤，用文火加熱炒干，粉碎，粉末過3號篩，備用.

2.2 樣品的提取

2.2.1 連續(xù)回流提取法

取粉末2g,精密稱定，用75%的無水乙醇250ml提取至完全，抽濾，濾液定容至250ml，取濾液50ml滴加氨水至pH9.0，置真空干燥箱中蒸干，備用.同法平行提取3份.

2.2.2 常規(guī)水煮法

取粉末2g,精密稱定，置燒杯中，加入蒸餾水250ml，用環(huán)保爐加熱煮沸1.5h后，過濾，濾渣再加蒸餾水100ml煮沸1h后取出，過濾，如此反復(fù)至提取完全，合并濾液并定容至250ml，取50ml滴加氨水至pH9.0，置真空干燥箱中蒸干，備用.同法平行提取3份.

1）系統(tǒng)程序設(shè)計有待優(yōu)化。實現(xiàn)教改課題項目的信息化管理，最為關(guān)鍵的問題是實現(xiàn)教改項目數(shù)據(jù)的全面采集和挖掘，但教改項目的數(shù)據(jù)很多是以文本、關(guān)鍵詞等為代表的非結(jié)構(gòu)化數(shù)據(jù)，雖然系統(tǒng)設(shè)計時已經(jīng)完善了項目申報書格式內(nèi)容，盡可能采集具有可分析、可統(tǒng)計的結(jié)構(gòu)化數(shù)據(jù)，但是在試用中發(fā)現(xiàn)，在一些程序設(shè)計上，如教師的論文發(fā)表情況這個采集點，系統(tǒng)沒有進行限定性的選擇和引導(dǎo)，導(dǎo)致收集的相關(guān)數(shù)據(jù)格式不一，無法進行有效分析。

2.2.3 溫浸提取法

取粉末2g,精密稱定，置錐形瓶中加入75%的無水乙醇250ml封口置80℃恒溫水浴鍋中溫浸24h，抽濾，濾液定容至250ml，取50ml滴加氨水至pH9.0，置真空干燥箱中蒸干，備用.同法平行提取3份.

2.2.4 微波提取法

取粉末2g,精密稱定，置錐形瓶中加入75%的無水乙醇250ml,置于微波樣品處理器中提取30min，溫度設(shè)置60℃，功率300W，提取液抽濾，定容至250ml，取50ml滴加氨水至pH9.0，置真空干燥箱中蒸干，備用.同法平行提取3份.

2.2.5 滲漉法

取粉末2g，精密稱定，置于滲漉裝置中,加75%無水乙醇250ml，滲漉30h,抽濾，濾液定容至250ml，取50ml滴加氨水至pH9.0，置真空干燥箱中蒸干，備用.同法平行提取3份.

2.2.6 超聲提取法

2.3 色譜條件

色譜柱為AgilentTC-C18(2)色譜柱（250×4.6mm，5μm），流動相為甲醇:0.3%三乙胺（冰醋酸調(diào) pH至 6.5）（55:45），檢測波長 280nm，流速1.0ml/min，柱溫30℃，進樣量 20μl.

2.4 對照品溶液的制備

精密稱定延胡索乙素標準品0.5mg，置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，即得每1ml含0.05mg的對照品溶液.

2.5 供試品溶液的制備

將2.2項中制備的各提取物加甲醇溶解并定容至10ml，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液.

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 線性關(guān)系考察

精密吸取延胡索乙素對照品儲備液，以甲醇配制成 10μg/ml、20μg/ml、25μg/ml、30μg/ml、35μg/ml、40μg/ml、50μg/ml對照品溶液，分別吸取20μl注入高效液相色譜儀，測定峰面積.以峰面積為縱坐標，進樣量為橫坐標，繪制標準曲線，計算線性回歸方程.

2.6.2 精密度試驗

精密吸取延胡索乙素對照品溶液20μl，按上述色譜條件重復(fù)進樣5次，記錄峰面積，計算延胡索乙素峰面積的RSD值.

2.6.3 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，分別在0,2,4,8,12和24h進樣分析，測定延胡索乙素的峰面積值，計算RSD值.

2.6.4 重復(fù)性實驗

取元胡同一份供試品溶液，按上述色譜條件進行5次平行實驗，測定延胡索乙素的含量，計算RSD值.

2.6.5 加樣回收率實驗

精密稱取已知含量的醋炙元胡藥材粉末約0.2g，6份，精密加入延胡索乙素的對照品貯備液適量，按“2.5”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”項色譜條件下測定，計算回收率.

2.7 樣品含量測定

取各提取好的樣品，按“2.5”項下方法制備供試品溶液，精密吸取各供試品溶液20μl，按“2.3”項下色譜條件測定峰面積，計算延胡索乙素的含量，各提取方法3份取平均值.

3 結(jié)果與討論

3.1 RP-HPLC色譜圖

對照品與樣品色譜圖見圖1.

3.2 方法學(xué)考察結(jié)果

3.2.1 線性關(guān)系考察

對照品濃度與色譜峰面積的線性回歸方程為y=14391x-11523(R2=0.9992)，線性范圍為 10～50μg/ml.

3.2.2 精密度試驗

延胡索乙素對照品連續(xù)進樣5次后，色譜峰面積的 RSD（n=5）為 1.28%.

圖1 延胡索乙素標準品(A)和樣品(B)的RP-HPLC圖

3.2.3 穩(wěn)定性試驗

同一供試品溶液分別在0,2,4,8,12和24h進樣分析，色譜峰面積RSD為1.41%.表明該方法有較好的穩(wěn)定性.

3.2.4 重復(fù)性實驗

元胡同一供試品溶液進樣5次后，延胡索乙素的含量RSD為2.10%，表明樣品測定重復(fù)性良好.

3.2.5 加樣回收率實驗

加樣回收率實驗延胡索乙素的平均回收率為99.03%，RSD（n=6）為 1.02%.結(jié)果見表 1.

表1 回收率試驗結(jié)果

3.3 含量測定結(jié)果及討論

各樣品延胡索乙素含量測定結(jié)果見表2.從結(jié)果中看到，用水作為提取溶劑時,延胡索乙素的溶出量明顯低于用75%的無水乙醇的溶出量，在同樣用75%的無水乙醇提取時，連續(xù)回流提取法和超聲提取法提取率都較高.這是因為延胡索乙素是原小檗堿類叔胺堿，以游離狀態(tài)存在，易溶于有機溶劑，不易溶于水，而傳統(tǒng)中藥都是用水煎煮，所以臨床中醫(yī)使用時都是經(jīng)過醋制后，使延胡索乙素上的N原子接收質(zhì)子后由叔胺堿轉(zhuǎn)變成季銨鹽，增加水溶性，使其易于煎煮溶出，但從結(jié)果看出，雖然實驗樣品用的是醋制品，但是在水溶液中的提取率還是很低，并不能使延胡索乙素提取完全，所以單純水煎煮對有效成分的利用率比較低，這也可能是因為醋炙時并沒有使所有的延胡索乙素從叔胺堿變成季銨堿，所以游離的那部分并不能溶于水，而不管延胡索乙素是游離態(tài)還是成鹽的狀態(tài)，都是可以溶于乙醇的，所以其他的提取方法都比常規(guī)水煮法提取率高.

表2 樣品中延胡索乙素含量

4 結(jié)論

本實驗采用不同的提取方法對延胡索中的延胡索乙素進行了提取和含量測定，除了常規(guī)水煮法，其他方法都是使用相同的溶劑進行了提取，從測定的結(jié)果可以看出，常規(guī)水煮法提取率最低，連續(xù)回流提取法提取率最高，所以，如果不是從中藥方劑中各藥的君臣佐使互相作用水煎煮去使用的話，在元胡提取時，還是采用連續(xù)回流提取法效果好，使藥物的有效成分能被充分利用.