親子鑒定中D18S51基因座突變分析與應對

楊玉有，張丹妍，楊智曦，李新生，呂 靜，馬明福，李練兵*

（國家衛生計生委出生缺陷與生殖健康重點實驗室/重慶市人口和計劃生育科學技術研究院/重慶市正鼎司法鑒定所，重慶 400020）

短串聯重復序列（short tandem repeats，STR）是一類廣泛存在于人類基因組中具有遺傳多態性的DNA序列。STR基因座于20世紀90年代初期首次被作為一種重要的遺傳標記應用于人類親權鑒定。目前，STR已經成為親權鑒定中應用最廣泛的遺傳標記。受誘變劑、放射線等許多因素影響，STR基因座可能會發生突變，導致親子鑒定中親代與子代的遺傳標記不符合遺傳規律，從而可能影響親子鑒定結果的正確性。因此在親子鑒定中，應調查各基因座的突變率，選取那些突變率低的遺傳標記。

D18S51基因座是位于18號染色體長臂的簡單四核苷酸重復序列，早期的STR擴增分型系統如英國法庭科學服務部建立的第二代復合擴增系統[1]和美國聯邦調查局發起建立的DNA聯合索引系統（Combined DNA Index System，CODIS）[2]均包含了該基因座。當下國內法醫DNA分型常用的Identifiler?試劑盒和Goldeneye?DNA身份鑒定系統20A試劑盒等也均包含了該基因座。本文作者通過上述兩個試劑盒在親子鑒定檢測工作中的應用，對STR基因座D18S51的突變現象進行了觀察與分析，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本

1030例親子鑒定案件樣品來源于重慶市正鼎司法鑒定所檢案。檢驗材料包括血樣、帶毛囊毛發等。

1.1.2 試劑與儀器

Identifiler?試劑盒、Veriti? Thermal Cycler PCR擴增儀和3130 Genetic Analyzer購自美國應用生物系統公司（Applied Biosystems，Inc.，ABI），Goldeneye? DNA身份鑒定系統20A試劑盒購自基點認知技術（北京）有限公司，STRtyper-10G試劑盒購自珠?？频巧锕こ逃邢薰?，AGCU 21+1 STR 熒光檢測試劑盒購自無錫中德美聯生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取

采用Chelex-100法提取樣本基因組DNA。

1.2.2 PCR擴增和電泳分型

三聯體親子鑒定采用Goldeneye? 20A試劑盒檢測，二聯體親子鑒定聯合采用Identifiler?試劑盒和STRtyper-10G試劑盒聯合檢測。如果出現可疑突變，則補充檢測AGCU 21+1 STR系統。擴增產物通過3130 Genetic Analyzer進行毛細管電泳，GeneMapper ID v3.2軟件進行基因型分型。

1.2.3 統計分析

親權指數（paternity index，PI）、累計親權指數（cumulative paternity index，CPI）的計算按文獻報道的方法進行[3-4]。計算所使用的相關等位基因分布頻率數據來自文獻[5]及試劑盒生產廠家所提供的頻率表。如果觀察到等位基因發生突變，則參考美國血庫協會（American Association of Blood Banks，AABB）和國際法醫遺傳學會（International Society for Forensic Genetics，ISFG）推薦的Brenner逐步突變模型計算PI值[3-4]；STR基因座突變率μ值見參考文獻[6]。

1.2.4 判定依據

判定親生關系的理論依據是孟德爾遺傳定律和行業規范[7]及專家共識[8]。經過累計非父排除概率（cumulative probability of exclusion，CPE）≥99.99%的遺傳標記系統的檢測，經過計算，被檢測男子的CPI小于0.0001時，排除被檢測男子是孩子的生物學父親；被檢測男子的CPI大于10000時，支持被檢測男子是孩子的生物學父親[7]。在支持親權關系的鑒定中，出現不符合遺傳規律的分型結果則考慮發生突變，增加檢測AGCU21+1STR試劑盒確證。在三聯體親權鑒定中，當考慮發生了突變時，子代新等位基因的來源根據子代新等位基因與親代等位基因的差異大小來確定，親代等位基因與子代新等位基因差異最小的一方定為突變來源方。

2 結 果

對存在可疑突變的案例，增加檢測AGCU 21+1系統，均未發現新的不符合遺傳規律的分型結果。

1030例鑒定中有856例鑒定認定親子關系，CPI均＞10 000；其中二聯體鑒定590例、三聯體鑒定266例，減數分裂觀察次數為1122；共發現突變30例，其中D18S51基因座突變8例，突變率為0.7130%。

8例突變案例中突變來源均為父方，均為一步突變，其中5例表現為重復單位的減少，2例表現為重復單位的增加，另外1例尚不能確定突變的等位基因及重復單位的增減。8例發生突變的等位基因的重復單位重復次數均在14次以上，均發生于堿基結構均一即重復次數為整數而不伴有不完全重復單位插入的等位基因，結果見表1。

表1 8例D18S51基因座突變的親權鑒定案例分析（n）

3 討 論

3.1 突變模式與突變步數

現有研究表明，STR基因座突變主要由復制滑動造成，該類突變符合逐步突變模式，一步突變大約占突變的90%[8]。本研究所發現的8例突變均為一步突變，未發現多步突變。

3.2 突變來源者民族

依據AABB 2008年度數據分析，民族也是STR基因座突變率差異的原因之一[9]，所以本調查標明了突變來源者的來源地區及民族以便于與其他地區及民族比較。

3.3 突變的來源

由于精子細胞分化經歷的細胞分裂次數比卵細胞多等原因，父源突變多于母源突變。本研究發現的8例突變均為父源突變。劉素娟等[10]對中國南方漢族10 000例肯定親子關系的三聯體親權鑒定案例進行分析，發現父源突變率與母源突變率的平均比值約為3.57：1，與Brenner[11]推薦的平均比值3.5較為接近。但AABB 2008年度的數據[9]也顯示這一比值在不同的基因座差異較大，最小為1.25倍，最大則達到18.466倍。

3.4 突變的基因座與突變率

STR基因座的突變率與等位基因中基序的堿基結構和重復次數有關[8]。AABB 2008年[9]的統計結果及李成濤等[12]對中國多地區人群數據的大樣本統計中，D18S51均是所統計基因座中突變率第三高的基因座，平均突變率分別為0.1808%和0.1666%；嚴江偉等[6]報道的D18S51基因座平均突變率為0.060%；在劉素娟等[10]的統計結果中，D18S51則是突變率最高的基因座，平均突變率為0.23%。本調查所得到的D18S51突變率為0.7130%，高于上述文獻報道，可能與本次調查觀察的減數分裂次數有限有關，也可能與地區、種群差異有關。

3.5 突變的應對

李成濤等[12]研究表明，約100例單親親子鑒定或50例三聯體親子鑒定就可能遇上1～2例突變。因此，突變是親子鑒定檢案中一個不可回避的問題。

當檢測一定數量的STR基因座只有少數幾個基因座不符合遺傳規律時，應考慮突變的可能性。遇到此類情況后，建議首先用不同的試劑重復檢測，保證分型正確。然后計算疑似突變位點的PI值，計算突變率時建議盡可能采取本地區同種族人群大樣本調查所得的參數，在母源數據不充分的情況下，母源突變率可直接取值0.0005[7]。經過計算CPI，當CPI大于0.0001而小于10000時，應通過增加檢測遺傳標記來達到要求[7]；當CPI大于10000時，應慎重考慮，仍建議增加檢測新的遺傳標記：如果不存在親權關系，則會發現更多的不符合遺傳規律的基因座。

為了更全面地了解中國人群中親權鑒定常用STR基因座的突變規律，建議各地區學者加強對突變現象的觀察與報道，分析突變來源和類型，了解突變來源者的民族和年齡等更多、更加全面的信息，以實現數據共享和比較分析。