IgH基因重排聯合Bcl-2、Ki-67鑒別B細胞淋巴瘤和增生性病變的應用研究

張衛東

（吉林省吉林市中心醫院病理科，吉林 吉林 132011）

非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin's lymphoma，NHL）為血 液淋巴系統腫瘤，其發病率在腫瘤疾病排名靠前。疾病的確證過程主要通過組織活檢完成。目前，B細胞淋巴瘤在我國不僅治愈率較低，重要的是病理診斷過程易與一些不明原因的淋巴結增生性疾病相混淆，應該從遺傳學等免疫表型及分子水平進行檢測方能做出確切診斷。同時，國外有相關研究表明，超過80%的B淋巴細胞瘤的染色體存在異常，其中常見的18q21的Bcl-2基因易位及擴增較為常見[1-2]，且對B淋巴瘤的分型診斷及臨床預后具有重要的指導意義。但國內相關文獻研究涉及較少。本研究則對54名曾入住本院的B淋巴瘤患者的石蠟組織切片進行了熒光原位雜交（fluorescence in situ ybridization,FISH）分析及免疫組織化學分析，探討IgH基因序列重組作為新型生物診斷標記物Bcl-2、Ki-67的可行性。

基因重排是以淋巴細胞單克隆增生為遺傳背景，為B細胞淋巴瘤提供診斷依據。胚系狀態下，B細胞淋巴瘤的免疫球蛋白基因由四個區域組成，分別為恒定區、鏈接區、可變區、多變區。各區域會有不同長度的基因序列插入，隨著細胞發育的逐步進行，在特定酶的作用下，基因序列重新排列，構成結構基因，即為基因重排。B細胞淋巴瘤和增生性病變的B淋巴細胞的基因重排方式不同，從而導致淋巴瘤細胞的無限增殖特性[3]，因而會為臨床基因重排的診斷提供依據[4]。Kros等檢測的B細胞淋巴瘤IgH基因重排陽性率為77.0%，與王萍等[5]實驗檢測陽性率72.0%相近。Bcl-2蛋白作為凋亡抑制因子，對細胞凋亡有明顯抑制作用[6]，同時與患者預后有關。Bcl-2蛋白高表達主要見于濾泡性淋巴瘤[7]。

Ki-67在細胞周期中發揮作用，Ki-67基因高表達程度往往和B淋巴細胞的惡性增殖程度相關，同時也與B細胞淋巴瘤的惡性預后相關。由于Ki-67陽性率變異變化范圍較大，提示個體差異也比較明顯，Ki-67高表達與預后不良有關，檢測基因Ki-67現已被推廣應用于腫瘤增殖活性的檢測當中，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 本研究的54例NHL患者，均經本院由2016年10月～2017年10月期間診治,確診均由醫院病理科經過組織病理和免疫組織化學方法操作完成。其中彌漫性大B細胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）39例（占72%）、套細胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma）8例(占15%)，濾泡樣淋巴瘤（follicular lymphoma，FL）7例（占13%）。病理診斷標準參照2008年WHO淋巴瘤分類標準。對照組共54例淋巴增生性病變患者的經石蠟包埋的組織樣本。B細胞淋巴瘤患者與淋巴增生性病變患者兩組臨床資料比較差異無統計學意義。以上所有研究過程均通過患者同意并簽署知情同意書，包括同意相關實驗結果用于論文發表。也均經本院臨床試驗委員會批準通過。

1.2 試劑與方法 本研究方法通過免疫組織化學分析技術（IHC，Immunohistochemistry）識別分析B淋巴細胞的Bcl-2、Ki-67的表達情況。染色步驟嚴格按照說明書進行。首先經過冰凍切邊，甲醇、丙酮固定，PBS充分清洗石蠟切片，然后滴入未標記的鼠抗人一抗，放入37℃濕盒中孵育30 min，再用0.01 mol/L PBS清洗兩遍，每次時間為5 min，滴入帶有熒光標記的二抗進行染色，將標本再次放入37℃濕盒中孵育30 min，重復進行PBS清洗，最后利用甘油進行封片，同時在熒光顯微鏡下進行觀察。IHC實驗后所有實驗結果均經過兩名以上病理科醫師進行復核。

隨機挑選一張染色切片20個高倍視野。以細胞核內出現棕色顆粒的細胞數大于25%時為Ki-67陽性標記細胞、細胞數大于10%判定為Bcl-2陽性標記的細胞作為結果判定標準[8]。

熒光原位雜交技術（FISH）作為一種基因分析方法具有較高的靈敏度和分辨率。熒光原位雜交檢測IgH基因重組。熒光原位雜交技術通過有效安全的熒光標記的分子探針與目的基因進行原位雜交，顯示目的基因片段的DNA序列數量和相互的位置關系。此熒光原位雜交技術在細胞分子生物實驗技術領域具有極其重要的作用。

在此實驗研究中熒光原位雜交檢測探針包括兩部分，CEP8探針以綠色熒光Spectrum Green標記；Bcl-2基因特異性位點探針以紅色熒光SpectrumRed標記。3μm厚腫瘤組織切片事先固定后50℃培養箱中烤片3 h，甲酰胺變性3 min，再經冰乙醇脫水步驟，將變性DNA探針滴于標本上，37℃過夜，洗脫去除結合的非特在熒光顯微鏡下分別經紅色、綠色和藍色濾光片捕獲不同熒光。每例隨機選擇60個大小接近、完整清晰、染色均勻、細胞核無重疊的區域進行觀察。細胞核內出現3個或3個以上紅色信號判定為Bcl-2基因擴增[9]。

本研究利用熒光原位雜交技術檢測研究B細胞淋巴瘤患者和淋巴組織增生患者的IgH基因重排情況，并聯合應用組織化學等檢測方法檢測Bcl-2、Ki-67鑒別B細胞淋巴瘤和淋巴組織增生性病變，初步探討IgH基因重排聯合Bcl-2、Ki-67進而鑒別淋巴組織增生性病變和B細胞淋巴瘤，對B細胞淋巴瘤的早期診斷、評價療效等方面具有重要的意義。也對淋巴瘤患者進行準確的診斷及指導治療，達到延長患者生存時間，提高患者生存率具有重要意義。

1.3 統計學方法 應用SPSS 16.0進行統計學分析。計量資料以x±s表示，兩組間比較采用雙向無序的R×C表資料的χ2檢驗。顯著性檢驗水準為α=0.05；P＜0.05記為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Bcl-2基因檢測采用熒光原位雜交技術（FISH） 在熒光顯微鏡進行形態學下觀察，應用FISH圖像分析軟件完成采集圖像、分析并完整保存。正常IgH基因經過熒光原位雜交技術可見紅色和綠色相互融合的雜交信號，如果發生IgH基因重排，則其中綠色、紅色、黃色信號彼此分離并形成三個分離的信號，IgH基因重排顯示為≥3個黃色信號。將54例反應性增生的淋巴結標本按上述方法進行熒光原位雜交實驗，每份樣本分析400個細胞，計算出異常信號的細胞數，本研究將IgH基因易位陽性閾值定義為10%，即分析100個腫瘤細胞中出現10個及10個以上黃色熒光的陽性細胞判斷為IgH基因重排。IgH基因重排在B細胞淋巴瘤患者中的重排率，見表1。

表1 IgH基因重排在B細胞淋巴瘤患者中的重排率Table 1 Rearrangement Rate of IgH Gene Rearrangement in Patients with B-Cell Lymphoma

2.2 Bcl-2、Ki-67蛋白表達情況采用免疫組織化學法 結果判定：蛋白主要位于細胞核呈棕褐色、棕黃色或淺黃色表達代表陽性結果。根據既往蛋白免疫組化標準進行判讀，以腫瘤組織中陽性細胞進行百分率計數。同時，按照Hans等分類標準，以細胞核內出現棕色顆粒物質的細胞數＞25%時為Ki-67陽性標記細胞，細胞數＞10%判定為Bcl-2陽性標記的細胞作為結果判定標準。在B細胞淋巴瘤患者中Bcl-2、Ki-67蛋白表達情況見表2。

表2 在B細胞淋巴瘤患者中Bcl-2、Ki-67蛋白表達情況Table 2 Expression of Bcl-2 and Ki-67 Protein in Patients with B-Cell Lymphoma

實踐證明多種抗體聯合檢測的方法，對提高B細胞淋巴瘤診斷正確率具有重要作用。聯合檢測對淋巴瘤與淋巴細胞增生性病變的鑒別診斷及預后判斷較單一抗體檢測更為可靠。在B細胞淋巴瘤患者中IgH基因重排、Bcl-2、Ki-67蛋白表達情況見表3。在分子水平尋找分子靶位，對腫瘤的個體化和預見性治療具有指導意義。目前本院應用熒光原位雜交技術檢測IgH基因還處于原始階段，我們將此結論應用于臨床，幫助患者鑒別淋巴瘤與淋巴結增生性疾病，提高患者生存治療。為鑒別淋巴瘤與淋巴結增生性疾病的診斷提供可靠的科學依據。

表3 在B細胞淋巴瘤患者中IgH基因重排、Bcl-2、Ki-67蛋白表達情況Table 3 Expression of IgH gene rearrangement,Bcl-2,Ki-67 protein in patients with B-cell lymphoma

3 討論

基于血漿的B細胞淋巴瘤診斷方法，可能為腫瘤治療的療效評價提供了一種新途徑。在循環血中能找到各種實體腫瘤突變的DNA，初步分析證實了這些重組基因序列的存在，在很多情況下，這些檢測應用于臨床非常有價值。

本研究未從血漿檢測中發現重組基因的患者，其原因可能是經過治療后病情達到完全緩解。總之，對已經接受治療的B細胞淋巴瘤患者進行IgH基因檢測是一種個性化的先進的監測方法[9]，通過檢測患者重組IgH基因重排情況進行診斷和評價，這不僅是在科學研究領域上的一大突破，也為臨床監測NHL患者病情提供了可能。

B細胞淋巴瘤患者的Bcl-2和Ki-67基因易位與B細胞淋巴患者Bcl-2和Ki-67蛋白表達關系密切。因此，對于Bcl-2和Ki-67蛋白表達陽性的患者，發生Bcl-2和Ki-67基因易位的可能性較二者均陰性患者發生幾率大，經本研究發現，建議利用FISH檢測方法，需在常規檢測前提下進一步指導B細胞淋巴患者臨床治療。Bcl-2和Ki-67基因擴增也是B細胞淋巴瘤患者腫瘤細胞內基因異常的重要方式，但目前對其作用機制尚無明確結論，還需要進一步深入研究。

綜上所述，IGH基因重排聯合Bcl-2、Ki-67對B細胞淋巴瘤和增生性病變有重要的鑒別意義。