贛南地區(qū)碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌的基因型研究

歐陽琳，謝麗，鐘貞玲

（興國縣人民醫(yī)院檢驗科，江西 贛州 342400）

陰溝腸桿菌是一種重要條件致病菌，廣泛存在于自然界中，隨著頭孢菌素臨床廣泛使用，日益成為醫(yī)院感染重要病原菌[1]。碳青霉烯類抗生素是一類非典型β-內(nèi)酰胺抗生素，抗菌譜廣泛，抗菌活性強，安全性高[2]。由于臨床治療中碳青霉烯類抗生素不規(guī)范使用，部分陰溝腸桿菌出現(xiàn)耐藥趨勢，嚴重影響臨床抗感染工作[3]。為了解贛南地區(qū)碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌的基因型，本研究選取2015年9月～2016年9月贛南地區(qū)5所綜合性醫(yī)院分離的60株碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌，采用生物分子技術(shù)進行研究。

1 材料與方法

1.1 菌株來源與鑒定 收集2015年9月～2016年9月贛南地區(qū)5所綜合性醫(yī)院分離的碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌共60株。質(zhì)控菌采用大腸埃希菌（ATCC25922）與產(chǎn)酸克雷伯菌（ATCC700324）。

1.2 藥物敏感性試驗 采用微量肉湯法對納入菌株進行藥敏測試，觀察納入菌株對亞胺培南、美羅培南、厄他培南、阿莫西林、阿莫新林/克拉維酸、哌拉西林、哌拉西林/他挫巴坦、替卡西林、替卡西林/克拉維酸、頭孢呋辛、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟、頭孢替坦、阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、復方新諾明、環(huán)丙沙星等19種抗菌藥物的耐藥情況。測定結(jié)果參考美國臨床和實驗室標準協(xié)會標準（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）[4]。

1.3 改良Hodge實驗 使用無菌生理鹽水將待檢陰溝腸桿菌稀釋后涂抹于MH瓊脂平板，將美羅培南紙片貼于MH瓊脂平板，從紙片邊緣放射狀劃線，放入孵育箱，24 h后取出判讀結(jié)果，美羅培南抑菌圈內(nèi)出現(xiàn)待檢陰溝腸桿菌矢狀生長增強者即可判讀為陽性。

1.4 基因檢測 采用聚合酶鏈式反應（PCR）法檢測耐藥菌株中編碼碳青霉烯酶（NDM型、IMP型、VIM型、KPC型）及超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（CTX-M-1型、CTX-M-2型、CTX-M-9型）耐藥基因。結(jié)果與GenBank序列（BLAST）進行比較分析，鑒定碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌基因類型。

2 結(jié)果

2.1 60株碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌對抗菌藥物的藥敏率 60株碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌對碳青霉烯類抗生素亞胺培南、美羅培南、厄他培南均具有較高耐藥性，耐藥率≥90.0%；對阿米卡星、妥布霉素、環(huán)丙沙星、復方新諾明、慶大霉素耐藥性較低，耐藥率在25.0%～53.3%，見表1。

表1 60株碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌對抗菌藥物的藥敏率Table 1 60 antimicrobial susceptibility of carbapenem resistant Enterobacter cloacae

2.2 基因檢測結(jié)果 60株碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌中，51株檢測出攜帶碳青霉烯酶基因，檢出率為85.0%，包括NMD型18株（20.0%）、IMP型22株（36.7%）、KPC型13株（21.7%），其中NMD型合并IMP型2株（3.3%），見表2。

表2 60株株碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌基因檢測結(jié)果Table 2 60 gene detection results of carbapenem resistant Enterobacter cloacae strains

3 討論

陰溝腸桿菌是革蘭陰性粗短桿菌，廣泛存在于土壤、水體、植物等自然界中，在人體腸道內(nèi)也可檢測出陰溝腸桿菌[5]。碳青霉烯類抗菌藥物是一類非典型β-內(nèi)酰胺抗生素，化學結(jié)構(gòu)與青霉素類青霉環(huán)相似，但與青霉素順式構(gòu)象，具有廣泛抗菌譜、極強抗菌活性、高度穩(wěn)定性，可以抑制細胞壁站臺合成酶，破壞細菌胞壁，溶解殺滅細菌，同時對細菌有選擇性抑制殺滅作用，毒副反應較小[6]。目前臨床常用碳青霉烯類抗生素包括亞胺培南、美羅培南、帕尼培南、厄他培南、比阿培南、多尼培南等[7]。隨著廣譜抗菌藥物廣泛使用，部分陰溝腸桿菌出現(xiàn)碳青霉烯類耐藥現(xiàn)象，給臨床抗感染治療工作帶來巨大挑戰(zhàn)。

近年來研究顯示，碳青霉烯耐藥機制主要為產(chǎn)碳青霉烯酶與超廣譜β-內(nèi)酰胺酶[8]。產(chǎn)碳青霉烯酶指可以水解亞胺培南或美羅培南的β-內(nèi)酰胺酶，根據(jù)Ambler分子分型可分為A類絲氨酸酶、B類金屬酶、D類絲氨酸酶，其中B類金屬酶是產(chǎn)碳青霉烯酶主要類型，較其他廣譜β-內(nèi)酰胺酶具有更高水解活力[9]。B類金屬酶即金屬β-內(nèi)酰胺酶，多來自于自然界中微生物，常見于銅綠假單胞菌、腸桿菌科細菌、不動桿菌屬，可由細菌染色體DNA編碼，能對黃桿菌、芽孢桿菌、脆弱擬桿菌等單胞菌屬產(chǎn)生耐藥作用，尤其可以使腸桿菌獲得碳青霉烯酶類抗生素耐藥性[10]。迄今實驗研究已發(fā)現(xiàn)9種B類金屬酶，分別為KHM酶、SPM酶、GIM酶、DIM酶、AIM酶、VIM酶、IMP酶、NDM酶、SIM酶，在臨床中最為常見的基因型為SPM酶、VIM酶、IMP酶、NDM酶[11]。SPM酶目前主要見于南美綠膿桿菌，我國出現(xiàn)較少[12]。相關(guān)研究顯示，VIM酶可以使腸桿菌產(chǎn)生較高耐藥性[13]。NDM酶是新近檢測到的可獲得性B類金屬酶，最早在肺炎克雷伯桿菌中發(fā)現(xiàn)，在全球范圍內(nèi)均有一定報道，具有較強傳播能力，在臨床抗感染治療中得到越來越多重視[14]。IMP酶是最早發(fā)現(xiàn)的B類金屬酶，在多種腸桿菌中檢測出現(xiàn)，尤其是不動桿菌與綠假單胞菌。IMP酶具有多種亞型，具有較強傳播能力，可水解碳青霉烯類抗生素，但對替莫西林耐藥作用[15]。KPC酶是A類絲氨酸酶，最早在肺炎克雷伯桿菌中發(fā)現(xiàn)，表現(xiàn)出高度亞胺培南與美羅培南耐藥性，傳播機制目前尚不明確，可合并腸桿菌科、銅綠假單細胞菌、不動桿菌屬膜孔蛋白，致菌株產(chǎn)生碳青霉烯類抗生素耐藥性。KPC酶不僅在美洲各地傳播蔓延，近年來在我國也有一定報告發(fā)現(xiàn)，逐漸成為我國公共衛(wèi)生健康安全重大問題[16]。本次調(diào)查研究顯示，60株碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌中，51株檢測出攜帶碳青霉烯酶基因，NMD酶、IMP酶、KPC酶是引起陰溝腸桿菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的重要原因。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶是一類β-內(nèi)酰胺酶，主要由質(zhì)粒介導，對青霉素、頭孢菌素、氨曲南等氧亞氨基β-內(nèi)酰胺類抗生素具有水解活性，常見于大腸桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、不動桿菌等。CTX-M酶是流行最廣的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶，主要見于大腸埃希菌、產(chǎn)期腸桿菌等，對窄譜頭孢菌素具有極強水解活性。相關(guān)研究顯示，CTX-M酶可致部分腸桿菌產(chǎn)生碳青霉烯耐藥性[17]。本研究60株碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌共檢出9例陽性CTX-M酶，提示CTX-M酶也可能導致陰溝腸桿菌碳青霉烯類抗生素耐藥性。

綜上所述，NMD酶、IMP酶、KPC酶為碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌主要基因類型，CTX-M酶也可能對陰溝腸桿菌碳青霉烯類耐藥性產(chǎn)生一定影響。