彌漫性大B細胞淋巴瘤患者HGAL和miR-155的相關性研究

盧杰，高莉莉，鄧珊珊，程丹丹，姜世君

（大慶醫學高等專科學校，黑龍江 大慶 163312）

腫瘤是一種多基因疾病，目前已發現的與腫瘤相關的基因在500種以上，腫瘤分子病因的復雜性和多樣性決定了腫瘤研究工作的艱巨性，淋巴細胞發生了惡變即稱為淋巴瘤，按照“世界衛生組織淋巴系統腫瘤病理分類標準”大體可分為霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤兩大類。在我國，彌漫大B細胞淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤中最常見的類型，幾乎占所有病例的1/3，主要是“侵襲性”或“中高度惡性”淋巴瘤。DLBCL的診斷可以依據典型的臨床表現，如淋巴結腫大。目前，唯一可靠的診斷DLBCL的標準是組織病理學檢查結果[1]。因而發掘彌漫大B細胞淋巴瘤腫瘤標志物是非常有必要，本項目檢測彌漫性大B細胞淋巴瘤患者和正常體檢者miR-155、HGAL和RhoA的相對表達水平，探討miR-155與HGAL及RhoA的關系，及以上診斷標志物與彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）發生進展的關系，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器 TRIZOL、Lipo2000購自美國Invitrogen公司；M-MLV逆轉錄酶、dNTP、DL2000、SYBR Real Time試劑盒，購自 TaKaRa公司；RNase Inhibitor、DNase I、Loading Buffer購自美國Fermentas公司；Real Time PCR 8聯管購自美國BIO-RAD公司；血清總蛋白提取試劑盒，普利萊基因技術有限公司；2720型PCR儀為美國ABI公司產品，Chromo4熒光定量PCR儀為美國BIO-RAD公司產品。Anti-GCET2/HGAL antibody(ab89180)，Anti-RhoA antibody(ab54835)，Anti-GAPDH antibody(ab37168)購自ABCAM公司。miR-155 mimics由上海生工生物工程有限公司合成；Dual-Luciferase? Reporter Assay System，E1910為Promega公司產品；熒光酶標儀微孔板檢測系統是Spectra Max M5e。

1.2 方法 ①樣品的采集：采集大慶市龍南醫院新入院且未放化療或手術的彌漫性大B細胞淋巴瘤患者靜脈血20份，以EDTA-K2抗凝管采集抗凝血，取職工體檢時抽取的靜脈血作對照，經病理類型組織細胞學、影像學、臨床表現等確診。②引物設計：Primer premier 5.0軟件設計并合成特異性引物。引物設計情況：HGAL：正向引物：GAGAAAACAGGCGGCAGC-3’；反向引物：GCAGAAACACCCTTCAGCG-3’，產物長度116 bp。RhoA：正向引物：ATTGTTGGTGATGGAGCCTGT-3’；反向引物：CCCACAAAGCCAACTCTACCT-3’，產物長度148 bp。GAPDH：正向引物：ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3’；反向引物：GTTGAGGTCAATGAAGGGGTC-3’，產物長度123 bp。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。miR-155：RT引物：CGCTGCTACCTGAGAGTAGACCAGATGCAGCGACCCCT；正向引物：TTAATGCTAATCGTGATAG；反向引物：ACCTGAGAGTAGACCAGA；產物長度 48bp。U6：RT引物：AACGCTTCACGAATTTGCGT；正向引物：CTCGCTTCGGCAGCACA；反向引物：AACGCTTCACGAATTTGCGT；產物長度94 bp。③總RNA的提取：用TRIZOL通用型RNA快速提取試劑盒，提取樣品RNA，最后加入30μl無RNase的水，溶解RNA。④RNA反轉錄為cDNA：RNA反轉錄為cDNA的操作程序如下：4μlRNA模板、2μl RT-buffer、1μl dNTP、1μl OligodT引物、10μl DEPC水，混勻，70 ℃ 5 min，立即冰浴，加入1 μl RNase Inhibitor、1 μl M-MLV，反應條件：30 ℃ 10 min；42 ℃ 60 min；70℃ 10 min。⑤Real Time PCR檢測：取0.2 ml薄壁PCR管，分別編號，體系如下：SYBR Premix Ex TaqTM（2×），10 μl；PCR 正向引物（10 μM），1 μl；PCR 反向引物（10μM），1μl；Rox（50×），0.4μl；cDNA模板，1μl；ddH2O，6.6 μl；20.0 μl反應體系。混勻，置于熒光定量PCR儀中。變性，95℃ 30 s；40個循環：95℃ 5 s，60℃ 15 s；溶解曲線：95℃ 15 min；60℃ 1 min；95℃ 15 min；用不含cDNA模板的ddH2O作為陰性對照，用GAPDH作為內參。可以通過溶解曲線驗證引物的特異性和結果的可信度。采用2-△△Ct法計算基因的相對表達量。⑥western-blotting試驗：首先提取血清中的總蛋白，每100μl血清樣本加入200μl含蛋白酶抑制劑的蛋白提取解液，之后放冰上30min；14000 rpm離心20 min；取上清，加入4x蛋白Loading buffer，進行SDSPAGE電泳和western-blotting檢測。采用ECL發光檢測：將ECL化學發光試劑盒中的試劑A和B進行等體積混勻，然后滴到PVDF膜上，2 min后，將PVDF膜放到保鮮膜上，用濾紙將殘余液體吸干，保鮮膜覆蓋完全，在暗盒內將膜與X膠片曝光約5 min，然后用顯影液顯影后再用定影液進行定影。用圖像分析系統對Western blot目的條帶進行灰度測定，再用Quantity One軟件對該結果進行灰度分析。⑦雙熒光素酶檢測結果a：pSicheck-2-3UTR載體的構建：HGAL3′-UTR（長度2 613 bp）擴增引物：上游引物：CCGCTCGAGTGAAGTGGCTGGACTAGCATTTG-3’下游引物：ATAAGAATGCCCGGGCTTTGGGACATTAAAATTTATTTACTGG-3’；PCR產物和pSicheck-2載體分別用XhoI和NotI進行雙酶切，然后進行連接，轉化到top10大腸桿菌中，次日挑取克隆進行酶切鑒定和測序驗證。陽性克隆命名為pSicheck-HGAL-UTR。b：HELA細胞培養和共轉染：轉染前24 h接種HELA細胞到96孔細胞培養板；次日早晨細胞長至85%密度的時候按照以下準備轉染材料，見表1。

表1 轉染體系（μl）Table 1 Transfection system(μl)

pSicheck-HGAL-UTR、miR-155mimic和miR-155NC均為100 ng/μl。表達質粒和報告質粒以脂質體法（Lipofectamine 2 000）瞬時轉染HELA細胞，按照上表的量轉染。轉染后48 h后提取HELA細胞總蛋白。參考E1910試劑盒進行海腎熒光素酶和螢火蟲熒光素酶的活性檢測；用Graph-Pad Prism 4.0軟件對結果進行分析。

2 結果

2.1 MicroRNA熒光定量PCR結果 檢測DLBCL患者和健康人血清中的miR-155，見圖1。由圖可以看出，DLBCL患者血清中的miR-155高于健康人，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 熒光定量PCR結果 對HGAL和RhoA進行熒光定量PCR，見圖2。由圖可以看出，DLBCL患者血中HGAL和RhoA mRNA表達都低于正常人，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 miRNA熒光定量PCR結果Figure 1 Quantification results of miRNAdetected by Quantitative Real-time PCR

圖2 HGAL和RhoA熒光定量PCR結果Figure 2 Quantification results of HGAL and RhoAdetected by by Quantitative Real-time PCR

2.3 western-blotting結果 對HGAL和RhoA進行熒光定量PCR，見圖3。由圖可以看出，DLBCL患者血清中HGAL和RhoA蛋白表達都低于正常人，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖3 HGAL和RhoA western-blotting結果Figure 3 HGALand RhoAexpression by western-blotting注：A：western-blotting結果；B：數值化處理結果

2.4 雙熒光素酶檢測結果 pSicheck-HGAL-UTR克隆分別用XhoI和NotI進行的雙酶切，見圖4。可以看出得到2 600 bp左右的HGAL 3′-UTR的PCR產物大小和pSicheck-2載體大小約6 200 bp的兩個特異性條帶。說明成功將HGAL 3′-UTR克隆到了pSicheck-2載體中，因此可以進行下一步轉染試驗。

為了研究miR-155與HGAL表達的相關性，我們構建了HGAL的3′-UTR的雙熒光素酶報告基因載體。同時分三組進行試驗：第一組：UTR+NC組，即轉染一個pSicheck-2-HGALUTR載體和mimic NC組；第二組：UTR+miR-155組，即轉染一個pSicheck-2-HGAL-UTR載體和能與之3′-UTR結合的miR-155 mimics；第三組：miR-155+vec組，即只轉染miR-155 mimics和pSicheck-2載體。之后對雙熒光素酶進行鑒定，見圖5。由圖可以看出，第一組的比值高于第二組和第三組，差異有統計學意義（P＜0.05），原因是HGAL的3′-UTR能夠增強hRluc的表達；第二組的值低于第一組的原因是，miR-155和HGAL的3′-UTR結合后，降低了hRluc的表達。第二組的值高于第三組的原因是，hRluc沒有3′-UTR的作用，因此表達很低，同時，miR-155也沒有發揮作用。

圖4 pSicheck-2-HGAL-UTR雙酶切鑒定結果Figure 4 pSicheck-2-HGAL-UTR digested and characterized注：1：DL15 000 DNA Marker：250,1 000,2 500,5 000,75 000,1 000,15 000 bp；2：pSicheck-2-HGAL-UTR用XhoI和NotI進行的雙酶切鑒定結果

圖5 雙熒光素酶檢測結果Figure 5 Resuts of dual luciferase

3 討論

微小RNA（MicroRNAs，miRNAs）是長度約22 nt的內源性單鏈小RNA，來源于染色體上的非編碼區，具有高度的保守性[2]。可與編碼蛋白質的mRNA互補結合，沉默，降解或抑制其表達，參與調控基因遺傳、生長發育、應激反應、新陳代謝、細胞增殖、分化、凋亡、腫瘤形成及疾病發生發展等多種生物學過程[3]，目前已經證實，miRNAs在血清中表現為顯著的腫瘤相關性、組織特異性和表達穩定性。已發現miRNAs在幾乎所有人類癌癥中都有表達失調，血清和體液中含有足夠穩定的miRNA的表達[4]。miRNAs有望成為功能性預后血清標志物和藥物反應的研究對象[5]，是基因表達的關鍵調控因子[6]。

血清miRNAs可能是一種理想的腫瘤標志物。腫瘤miRNA在血液中的存在可能是腫瘤死亡、溶解或者由腫瘤細胞釋放出miRNA到其周圍環境的結果[7]。研究表明，miRNAs在彌漫性大B細胞淋巴瘤患者的血清中是非常豐富的。目前已清楚，miR-155為具有致癌潛能的miRNAs之一[8]，在彌漫性大B細胞淋巴瘤的細胞增殖、細胞循環、細胞凋亡發揮重要作用[9]。葛等實驗表明，B細胞型非霍奇金淋巴瘤組血漿中miR-155表達量明顯高于正常對照組和淋巴結炎性腫大組[10]。Eis等用定量RT-PCR證明了原發性縱隔B細胞淋巴瘤中BIC的表達與miR-155的水平一致，表明BIC為miR-155的前體[11]。

將蛋白質組學技術具體應用到腫瘤研究中，就產生了腫瘤蛋白質組的學科。它以尋找腫瘤標志物為目的，以蛋白質組學方法為手段，結合腫瘤分子機制的基礎研究與腫瘤檢測、診斷等臨床研究，最終找到能應用于臨床的腫瘤檢測和治療的蛋白質靶標。miR-155可以通過BMP/TGF-β和Rho A等多種信號通路促進淋巴瘤的發生[12]，Huang等利用蛋白組學的方法揭示了，在彌漫大B細胞性淋巴瘤中miR-155直接與PIK3R1（p85α）3'-非編碼區互動，miR-155過表達下調p85α的轉錄和翻譯，大大激活了PI3K-Akt通路，從而解釋了miR-155在DLBCL作用的新的分子靶標[13]。應用IHC對四種差異表達蛋白EZR、PLEK、GSTP1、HSPB1蛋白表達在DLBCL組織樣本中進行驗證，初步確定這四種蛋白質表達與DLBCL的化療敏感性相關[14]。在B細胞不同分化階段發生腫瘤轉化而形成的DLBCL，提示不同的癌基因起源，包括BCL-6、HGAL、CD10、CD5、FOXP1等，并且這些癌基因標志物與患者預后相關[15]。

miR-155通過結合HGAL基因的3'非編碼區來直接下調其表達，以減少RhoA的活化作用，增強自發的或由某些化學誘導物導致的淋巴瘤細胞的能動性。Dagan等實驗發現，轉染了hsa-miR-155的細胞不僅HGAL蛋白的表達水平降低，而且HGAL mRNA的水平也下降了，說明miR-155不僅直接與HGAL基因的3'-UTR結合，降低蛋白的表達，而且干擾了HGAL mRNA的穩定性[16]。

本研究通過實驗發現DLBCL中的miR-155顯著高于，以及HGAL和RhoA顯著低于正常人；用雙熒光素酶報告基因檢測發現，miR-155能與HGAL的3′-UTR結合，進而降低hRluc的表達，間接表明，在體內，miR-155能與HGAL的3′-UTR結合降低HGAL的表達。因此認為DLBCL中HGAL的下調與miR-155的表達升高有關，miR-155和HGAL可以作為彌漫性大B細胞淋巴瘤的檢測標志物。而且這種外周血檢測方法，具有無創傷、易于檢測，可重復性高等優點[17]，因而外周血miRNA和蛋白質組合檢測可作為腫瘤早期診斷的標志物。