綜合評價法優選前列適安復方的提取工藝研究

（1南京中醫藥大學藥學院 江蘇 南京 210023）（2徐州市銅山區鄭集鎮中心衛生院 江蘇 徐州 221143）（3江蘇省中藥炮制重點實驗室 江蘇 南京 210023）（4南京中醫藥大學附屬鹽城市中醫院 江蘇 鹽城 224000）

前列適安片為醫院制劑，具有補腎強本，行淤導濁的功效。用于治療老年前列腺增生排尿困難、前列腺痛等。該處方主要由黃芪、仙靈脾等14味藥材組成，其中仙靈脾、仙茅為該制劑中君藥。仙靈脾具有溫腎壯陽、強筋骨、祛風濕的功效[1]，所含的黃酮類、多糖及淫羊藿苷為主要抗炎活性成分[2]。仙茅具有溫腎壯陽、祛寒除濕等功效[5]，可延緩生殖系統衰老、提高免疫力[6]。仙茅單體成分仙茅素A具有補腎壯陽作用[7]。綜合考慮制劑成型工藝及臨床療效，通過查閱文獻，將該方中的仙茅、仙靈脾等4味藥材進行乙醇提取，黃芪、當歸等7味藥材進行水煎煮提取[8-10]。為確定合理的提取工藝，保證制劑質量和療效，本實驗以黃芪甲苷、阿魏酸及淫羊藿苷的含量作為評價指標，采用正交實驗設計優化提取工藝參數，為進一步開發利用該處方提供參考。

1.儀器與試藥

1.1 儀器

美國Waters e2695高效液相色譜儀；電加熱套（通州市申通電熱器廠）；電熱恒溫熱風干燥箱（DHG-9023A型，上海精宏實驗設備有限公司）；數顯恒溫水浴鍋（HH-2型，國華電器有限公司）；超聲波清洗器（KQ-500B型，昆山市超聲儀器有限公司）；電子天平（JY1002型，上海浦春計量儀器有限公司）；揮發油提取器；1000ml圓底燒瓶。

1.2 試藥

本實驗中所用的附子購自安徽孟氏中藥飲片有限公司，其余藥材均由徐州彭祖中藥飲片有限公司提供，均符合2015年版《中國藥典》相關項下規定。黃芪甲苷對照品（批號：MUST-17022804），阿魏酸對照品（批號：MUST-17010908），甲酸（批號：F1715004），淫羊藿苷對照品（批號：MUST-17051810）均為供含量測定用，購自成都曼斯特生物科技有限公司。液相用水為超純水；甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

2.方法與結果

2.1 水提工藝優選

2.1.1 因素水平設計 將黃芪、當歸等7味藥加水煎煮，以浸膏得率、黃芪甲苷和阿魏酸含量為評價指標，以加水量（A）、煎煮時間（B）、煎煮次數（C）為影響因素進行優化，因素水平表見表1。

表1 水提因素水平表

2.1.2 試驗方法 按處方比例稱取附片、黃芪等共9份，按表1條件加水提取，其中附片先煎半小時，過濾，合并濾液，減壓濃縮備用。

2.1.3 干浸膏得率測定 取濾液濃縮，置已干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干后置干燥箱60℃干燥至恒重，計算浸膏得率。

2.1.4 色譜條件 色譜柱為Kromasil C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；蒸發光散射檢測器檢測；流動相：水-乙腈（60∶40）；柱溫：40℃；漂流管溫度：100℃；氣體流速：2.6L?min-1；進樣量：10μl。以此色譜條件檢測黃芪甲苷的含量。色譜柱為Kromasil C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相為甲醇-0.1%甲酸（45∶55）；柱溫為25℃；檢測波長為320nm；流速為1ml?min-1；進樣量為10μl。以此色譜條件檢測阿魏酸的含量。

2.1.5 對照品溶液的制備 分別稱取黃芪甲苷及阿魏酸對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，依次制成505μg/ml、416μg/ml的溶液，即得儲備液。

2.1.6 供試品溶液的制備 取干浸膏粉0.5g，精密稱定，加20ml水溶解，正丁醇振搖提取4次，每次40ml，用氨試液洗滌，取正丁醇液，蒸干，置5ml容量瓶中，加甲醇適量使溶解，搖勻，即得黃芪甲苷供試品溶液。取干浸膏粉1g，稱定，置10ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，稱定重量，超聲30min冷卻后稱定重量，甲醇補足減失重量，濾過，即得阿魏酸供試品溶液。

2.1.7 標準曲線制備 分別精密吸取“2.1.1”項下黃芪甲苷儲備液和阿魏酸儲備液1ml，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，重復操作5次，即得系列對照品溶液。精密吸取各對照品溶液10μl進樣，按“2.1.2”項下色譜條件分別測定。以峰面積（y）為縱坐標，濃度（x）為橫坐標，繪制標準曲線，得黃芪甲苷和阿魏酸線性回歸方程分別為y=12039x-278071（R2=0.9942），y=53518x-134044（R2=0.9998）。結果表明黃芪甲苷和阿魏酸濃度分別在7.9～505μg/ml、3.25～416μg/ml范圍內與峰面積呈良好線性關系。

2.1.8 樣品含量測定 分別精密吸取黃芪甲苷和阿魏酸對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入高效液相色譜儀，測定，即得。

2.1.9 正交試驗及方差分析 按正交L9（34）試驗條件提取，共得到9份水提取液。依法測定黃芪甲苷、阿魏酸含量和干浸膏得率。結果見表2，方差分析見表3。黃芪甲苷和阿魏酸作為代表性成分的重要性大于浸膏含量。綜合評價各因素對指標的影響，對于三個指標來說B2C2都是最佳水平組，A對于阿魏酸含量是最主要因素，而對于其他兩個指標都是最次因素，所以選擇A3為最佳水平。顯著性水平取0.01，由方差分析得知除C因素對阿魏酸含量有顯著影響外，其余因素對三指標并無顯著影響。最終確定水提的最佳水平組為A3B2C2。

表2 水提正交試驗結果

表3 水提方差分析表

2.1.7 驗證試驗 稱取處方量藥材按優選的水提工藝進行試驗，平行操作3份。結果平均浸膏得率35.81%，RSD為1.1%；黃芪甲苷和阿魏酸平均含量分別為0.5257和0.1448mg/g，RSD分別為1.4%和1.7%。表明優選的水提工藝穩定可行。

2.2 醇提工藝優選

2.2.1 因素水平設計 將仙茅、仙靈脾、車前子、蓽澄茄按醇提工藝路線，通過L9（34）正交試驗設計，以淫羊藿苷含量和浸膏得率為評價指標，以乙醇濃度（A）、乙醇用量（B）、提取時間（C）為影響因素進行優化。因素水平表見表6。

表4 醇提因素水平表

2.2.2 試驗方法 按處方比例稱取4味藥材，按表4條件加對應濃度乙醇提取，其中車前子包煎，過濾，合并濾液，減壓濃縮備用。

2.2.3 醇提干膏得率測定 取濾液濃縮，置已干燥至恒質量的蒸發皿中，水浴蒸干后置干燥箱60℃干燥至恒重，計算浸膏得率。

2.2.4 色譜條件 色譜柱為Kromasil C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；蒸發光散射檢測器檢測；流動相為乙腈－水（30∶70）；柱溫為35℃；檢測波長為270nm；流速為1ml?min-1；進樣量為10μl。

2.2.5 對照品溶液的制備 取淫羊藿苷對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，制成492μg/ml的溶液，即得。

2.2.6 供試品溶液的制備 取2.2.3項下制得的干浸膏粉0.5g，精密稱定，置10ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，稱定重量，超聲處理30min，放冷，再稱定重量，甲醇補足減失重量，濾過，即得。

2.2.7 標準曲線的測定 精密吸取淫羊藿苷對照品溶液1ml，加甲醇1ml稀釋，用甲醇稀釋制備成標準品溶液。精密吸取10μl進樣，按“2.2.4”項下色譜條件測定峰面積。以峰面積（y）為縱坐標，濃度（x）為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為y=21187x-112840（R2=0.9994）。結果表明淫羊藿苷濃度在7.7～492μg/ml范圍內與峰面積呈良好線性關系。

2.2.8 樣品含量測定 分別精密吸取淫羊藿苷對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入高效液相色譜儀，測定，即得。

2.2.9 正交試驗及方差分析 按正交L9（34）試驗條件提取，測定淫羊藿苷含量和干浸膏得率。結果見表5，方差分析見表6。綜合評價各因素對指標的影響，B2對于兩個指標都是最佳水平，D、C對于兩個指標都是較為主要的因素，故選擇D1C1作為最佳水平組，A對于淫羊藿苷含量這個指標是最次因素，但對于浸膏得率卻是第二主要因素，故選擇A2作為最佳水平。顯著性水平取0.01，由方差分析得知三因素對指標并無顯著影響。最終確定醇提工藝的最佳水平組為A2B2C1D1。

表5 醇提正交試驗結果

表6 醇提方差分析表

2.2.6 驗證試驗 稱取處方量藥材按優選的水提工藝進行試驗，平行操作3份。結果平均浸膏得率9.83%，RSD為1.4%；淫羊藿苷平均含量為30.93mg/g，RSD為1.7%。表明優選的醇提工藝穩定可行。

3.討論

本處方由十四味藥組成，化學成分復雜，根據處方的功能主治結合有效成分的性質，選取浸膏得率和與功能相關的黃芪甲苷、阿魏酸、淫羊藿苷的含量作為評價指標，分別以正交試驗法和單因素考察法優選最佳工藝。本實驗選擇合適的方法提取復方中藥材的有效成分，以浸膏的形式入藥，可以減少服用量。藥材打粉后，出膏率和有效成分濃度比打粉前都有提高，但煎煮的藥材不宜粉碎過細，否則會對試驗結果產生影響。驗證性試驗結果表明該工藝條件具有可行性和實用性，為保證藥效和質量提供了科學依據，也為前列適安浸膏片的開發應用奠定了基礎。

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