安杰思AFD9600實時熒光定量PCR儀性能驗證

（四川省醫院科學院?四川省人民醫院檢驗科 四川 成都 610072）

鐘佳伶 王甲甲 魯代強 杜瓊 黃文芳（通訊作者）

實時熒光定量PCR因其良好的特異性和靈敏度，以及操作簡便，被廣泛用于病毒的定量檢測。病毒定量結果的準確性直接影響臨床醫生的診治[1-2]。實時熒光定量PCR儀作為檢測系統中的重要組成部分，對其性能進行驗證對保證檢測結果的準確性具有重要意義。AFD9600是由杭州安杰思醫學科技有限公司生產的實時熒光定量PCR儀。本文從精密度、正確度、線性及檢測下限方面對其性能進行了驗證。

1.材料和方法

1.1 材料

主要儀器：AFD9600實時熒光定量PCR儀（中國杭州安杰思醫學科技有限公司），低溫高速離心機，金屬浴等。儀器設備均在校準效期內。試劑：HBV核酸定量檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）（中國達安基因公司）。標準物質：北京康徹思坦公司（GBW(E)090137、 GBW(E)090138、 GBW(E)090139）。檢測標本：臨床中收集的患者新鮮血清。所有標本均于-20℃保存。

1.2 方法

1.2.1 精密度驗證 按照CLSI制定的驗證標準EP15-A2[3]要求進行分析。收集非脂血、非溶血的低、高值兩個水平的患者血清，每天檢測一個批次，每水平重復測定4次，連續測定4天，計算批內精密度（CV批內）和總精密度（CV總）。按照CNASCL36[4]中要求，以能力驗證/室間質評的評價界限（靶值±0.4對數值）作為允許總誤差(TEa)，重復性精密度＜3/5TEa，中間精密度小于＜4/5TEa為符合要求。

1.2.2 正確度驗證 使用3個標準物質進行正確度驗證。每個測定3次，計算平均值與靶值的相對偏倚。按衛生部臨檢中心HBV-DNA定量的室間質評活動標準，偏倚＜7.5%為驗證通過。

1.2.3 線性范圍驗證 收集臨床HBV-DNA高值標本，用陰性血清梯度稀釋（1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000、1∶1000000）。每個濃度檢測2次，取平均值與預期值相比較，計算線性相關系數。r＞0.98為符合要求。

1.2.4 檢測下限驗證 選取試劑盒中配套的標準品（2.0×103IU/mL），用陰性標準品稀釋至1.0×103IU/mL和5×102IU/mL。將標本檢測10次，9次檢出為符合要求。

1.2.5 質控 每次實驗均做室內質控，質控在控時，實驗結果有效。

1.2.6 統計學分析 所有定量數據經對數轉換后采用Excel2007軟件進行統計分析。

2.結果

2.1 精密度驗證

AFD9600檢測HBV-DNA低值和高值的CV批內分別為1.6%和1.3%，CV總分別為2.1%和1.6%。按CNAS-CL36要求，檢測所得CV值均在允許范圍內，驗證合格（見表1）。

表1 精密度驗證結果

2.2 正確度驗證

三個標準物質的檢測結果分別為1.84×103IU/mL、5.24×104IU/mL、5.40×106IU/mL。結果顯示偏倚均小于7.5%，驗證合格（見表2）。

表2 正確度驗證結果

2.3 線性范圍驗證

臨床中收集到的HBV-DNA高值標本定量為2.30×108IU/mL，梯度稀釋后進行檢測。檢測值與理論值的直線回歸方程為Y= 0.9937X-0.0697，線性相關系數r=0.9992，驗證通過（見表3、圖1）。

表3 線性范圍驗證結果

圖1 線性范圍驗證回歸曲線

2.4 檢測下限驗證

稀釋至1.0×103IU/mL和5×102IU/mL的標準品，分別進行10次檢測。濃度1×103IU/mL及5×102IU/mL的檢出率均為100%，CV分別為3.45%、5.97%（見表4）。

表4 檢測下限驗證

3.討論

隨著實時熒光定量PCR的推廣和應用，越來越多的國產實時熒光定量PCR儀現身于臨床實驗室中。安杰思AFD9600是由杭州安杰思醫學科技有限公司生產的96孔實時熒光PCR系統，其以鹵素燈作為光源，含5個檢測通道，激發光波長在400～800nm。檢測時，激發光通過光纖直接照射樣品，產生的熒光發射信號通過光纖、濾光片和透鏡抵達冷態CCD照相機，完成信號采集，實現定量檢測。

ISO15189[5]規定，儀器必須進行相關的性能驗證，才能投入臨床使用。本研究依據CNAS-CL36和CLSI要求，對AFD9600的性能進行了驗證。結果顯示，低值和高值的CV批內分別為1.6%和1.3%，CV總分別為2.1%和1.6%，符合衛生部標準及廠家聲明。正確度驗證結果顯示，3個標準物質檢測結果偏倚在-1.05%～3.49%，均在可接受范圍內。線性范圍驗證結果顯示，其線性范圍線性可覆蓋102～108IU/mL，涵蓋了絕大多數陽性標本濃度范圍，相關系數為0.9992，線性關系良好。靈敏度的驗證結果顯示，其靈敏度可達到5×102IU/mL，滿足臨床需求。

綜上所述，AFD9600型實時熒光定量PRC儀的正確度、精密度、線性范圍、靈敏度均達到衛生部的相關標準，滿足臨床需要，能夠在臨床分子生物實驗室投入使用。

[1]Berger A,Preiser W.Viral genome quantification as a tool for improving patient management:the example of HIV, HBV, HCV and CMV[J].J Antimicrob Chemother,2002,49（5）:713-721.

[2]王鳳嵐，黃朝芳，馮萬周.乙肝血清免疫標志物及HBV-DNA檢測結果相關性分析及臨床應用[J].臨床和實驗醫學雜志，2012，11（3）：203-204.

[3]Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI).User verification of performance for precision and trueness;approved guideline—Second Edition Document EP15-A2[S].Wayne,PA.USA,2005.

[4]CNAS-CL36：2012.醫學實驗室質量和能力認可準則在分子診斷領域的應用說明[S].中國合格評審國家認可委員會，2012.

[5]CNAS-CL02：2012.醫學實驗室質量和能力認可準則[S].中國合格評審國家認可委員會，2013.