2-甲氧雌二醇對低氧條件下皮膚成纖維細胞自噬水平及纖維化的影響

周 行 劉超凡 魯靜浩 朱鷺冰 李 明

(復旦大學附屬中山醫院皮膚科 上海 200032)

纖維化是皮膚愈合的重要過程之一,與手術切口愈合、燒傷后修復等密切相關。但過度纖維化不僅影響美觀,也降低皮膚保護、分泌和調溫等功能[1]。成纖維細胞是纖維化過程的主要效應細胞,不僅自身合成以Ⅰ型膠原(collagen type Ⅰ)為主的細胞外基質,還持續釋放結締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)等促纖維化細胞因子,進一步促進膠原合成[2]。纖維化組織內的缺氧環境可能通過促使成纖維細胞分裂增殖、誘發成纖維細胞自噬和啟動血管生成等途徑導致過度纖維化和疤痕增生[3]。因此,調控低氧條件下成纖維細胞的功能將有助于抑制過度纖維化。

臨床上尚無抑制過度纖維化的有效藥物,2-甲氧雌二醇(2-methoxyestradiol,2-ME)是人體內雌二醇的天然代謝產物,與雌激素受體的親和力幾乎為零,無雌激素不良反應[4]。我們前期的研究發現,2-ME能顯著抑制正常皮膚成纖維細胞的活化,減少膠原合成[5]。本研究進一步模擬皮膚組織內缺氧環境,應用低氧培養誘發正常皮膚成纖維細胞活化,研究2-ME對活化成纖維細胞的自噬水平及纖維化的影響。

材 料 和 方 法

主要試劑與材料胎牛血清、DMEM高糖培養基、胰蛋白酶(美國Gibco公司);二甲基亞砜(美國Sigma公司);Bafilomycin A1、ECL化學發光顯影液(美國Millipore公司);2-ME(美國MCE公司);抗人Ⅰ型膠原、CTGF、微管相關蛋白1輕鏈3 (LC3)B抗體(自噬標志物,英國Abcam公司);抗人低氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor 1 alpha,HIF-1α)抗體(美國R&D公司);抗人自噬降解標志物P62抗體(美國CST公司);山羊抗兔或小鼠二抗、雞抗兔熒光二抗(美國Thermo Fish公司);熒光染料4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(美國Roche公司)。CO2恒溫培養箱和三相細胞培養箱(美國Thermo公司);熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。

原代細胞培養與傳代局麻下切取健康志愿者的前臂正常皮膚組織,采用組織塊培養法[6]進行皮膚成纖維細胞原代培養。修剪去除皮下組織后,將皮膚剪成1 mm3左右碎塊,均勻接種于25 cm2培養瓶內,加入含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的DMEM,置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。組織塊邊緣可見梭形細胞爬出并呈貼壁生長,待梭形細胞長至80%匯合時,以含0.25%胰蛋白酶的平衡液消化細胞并傳代,實驗選用第3～6代細胞。本實驗方案經復旦大學附屬中山醫院倫理委員會批準,志愿者知情同意。

細胞低氧培養和藥物干預將上述成纖維細胞置于CO2恒溫培養箱(37 ℃,21% O2,5% CO2)中進行常氧培養或在三相培養箱中(37 ℃,1% O2,5% CO2)進行低氧培養。Bafilomycin A1和2-ME預先使用二甲基亞砜稀釋至16μmol/L和30 mmol/L儲存,使用前用細胞培養基稀釋為干預濃度。

Westernblot使用含苯甲基磺酰氟和磷酸化蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液充分裂解細胞后提取總蛋白。經上樣、電泳、轉膜、封閉后,依次加入一抗Ⅰ型膠原、CTGF、LC3B、HIF-1α、自噬降解標志物P62、內參β-actin及山羊抗兔或小鼠二抗,ECL顯影液顯影。圖像使用Image J軟件(由美國國立衛生研究院開發)分析,其中LC3B的圖像分析采用文獻[7]推薦的方法進行。

免疫熒光成纖維細胞接種在35 mm共聚焦培養皿中,常氧或低氧培養24 h后,以4%多聚甲醛固定10 min,0.1%Triton ×100破膜30 min,5%FBS封閉30 min,加入LC3B一抗置于4 ℃冰箱過夜,再加入雞抗兔熒光二抗,室溫孵育2 h,加入熒光染料后,在熒光倒置顯微鏡下觀察拍照,采用Image J軟件進行分析。

結 果

低氧對人皮膚成纖維細胞的纖維化和自噬相關蛋白質水平的影響成纖維細胞在低氧培養0、6、12、24 h后,HIF-1α水平隨低氧時間延長而升高,提示低氧模型成功建立。隨著低氧時間的延長,Ⅰ型膠原和CTGF蛋白質水平不斷增加,在低氧24 h時Ⅰ型膠原和CTGF水平較低氧0 h顯著升高(P<0.05,圖1A),呈時間依賴性。自噬標志物LC3Ⅱ水平隨著低氧時間的延長而逐漸升高,而自噬降解標志物P62水平隨著低氧時間的延長而逐漸減低,在低氧24 h時LC3Ⅱ水平顯著升高,P62水平顯著降低(P<0.05,圖1B),呈時間依賴性。與常氧培養的成纖維細胞相比,低氧培養24 h后成纖維細胞(圖2A)表達LC3熒光顯著增強(P<0.05,圖2B)。

Hypoxia groupvs.normoxia group,(1)P<0.05;(2)P<0.01.HIF-1α:Hypoxia-inducible factor-1α;CTGF:Connective tissue growth factor;LC3:Microtubule-associated protein 1 light chain 3.

圖1低氧條件下皮膚成纖維細胞的纖維化(A)和自噬相關蛋白(B)的水平
Fig1Fibrosis(A)andautophagy-relatedproteins(B)expressionofdermalfibroblastsafterexposuretohypoxia

BafilomycinA1對低氧培養的成纖維細胞纖維化和自噬相關蛋白的影響使用不同濃度自噬抑制劑Bafilomycin A1(0、5、10、50 nmol/L)干預并予低氧培養24 h后,成纖維細胞表達Ⅰ型膠原、CTGF減少,且隨Bafilomycin A1濃度的升高,Ⅰ型膠原、CTGF水平降低,而HIF-1α和LC3Ⅱ、P62等自噬相關蛋白水平增多。50 nmol/L的Bafilomycin A1干預組較未干預組的Ⅰ型膠原和CTGF水平顯著降低(P<0.05,圖3),LC3免疫熒光表達(圖2C)較未干預組(圖2B)顯著增強(P<0.05)。

2-ME對低氧培養的成纖維細胞纖維化和自噬水平的影響使用不同濃度2-ME(0、5、10、25μmol/L)干預后,低氧培養24 h成纖維細胞的HIF-1α、Ⅰ型膠原和CTGF水平下降,且隨2-ME濃度的升高,HIF-1α、I型膠原和CTGF水平不斷下降,自噬相關分子LC3Ⅱ水平下降,而P62水平升高,均呈濃度依賴性。25μmol/L 2-ME處理組與未干預組相比,HIF-1α、I型膠原和CTGF水平顯著降低(P<0.05,圖4)。25μmol/L 2-ME干預后,低氧培養24 h的成纖維細胞LC3免疫熒光水平(圖2D)較未干預組(圖2B)顯著減弱(P<0.05)。

討 論

正常的皮膚組織纖維化有助于手術或各種創傷后的皮膚缺損愈合,但過度纖維化會造成皮膚組織強度下降、功能缺失和外觀缺陷。目前認為皮膚組織纖維化后缺氧可能是進一步加重皮膚纖維化、形成疤痕增生的重要因素。HIF-1α活化促使成纖維細胞分裂增殖被認為是低氧誘發纖維化的重要機制之一[8]。Hong等[9]進一步研究認為,在低氧情況下,HIF-1α可能通過上調CTGF mRNA介導成纖維細胞膠原合成增加。本研究結果也提示,隨著低氧時間的延長,HIF-1α的水平增多,成纖維細胞表達CTGF和合成Ⅰ型膠原也隨之增多,這證實了低氧可導致成纖維細胞活化繼而引起纖維化。纖維化使血管與組織細胞的間距增加,進一步加劇缺氧,形成缺氧與纖維化的惡性循環。

A:Normoxia (21%O2);B:Hypoxia (1%O2);C:50 nmol/L Bafilomycin A1+hypoxia (1%O2);D:25μmol/L 2-ME+hypoxia (1%O2).

圖2BafilomycinA1和2-ME干預組皮膚成纖維細胞低氧培養24h后LC3的水平
Fig2EffectofBafilomycinA1and2-MEonLC3expressionindermalfibroblastsafterexposuretohypoxiafor24h

Bafilomycin A1 treatment groupvs.control group,(1)P<0.05;(2)P<0.01.HIF-1α:Hypoxia-inducible factor-1α;CTGF:Connective tissue growth factor;LC3:Microtubule-associated protein 1 light chain 3.

圖3BafilomycinA1干預組皮膚成纖維細胞低氧培養24h后纖維化和自噬相關蛋白的水平
Fig3EffectofBafilomycinA1onfibrosisandautophagyrelatedproteinsexpressionofdermalfibroblastafterexposuretohypoxiafor24h

2-ME treatment groupvs.control group,(1)P<0.05;(2)P<0.01.2-ME:2-methoxyestradiol;HIF-1α:Hypoxia-inducible factor-1α;CTGF:Connective tissue growth factor;LC3:Microtubule-associated protein 1 light chain 3.

圖42-ME干預組皮膚成纖維細胞低氧培養24h后纖維化和自噬相關蛋白的水平
Fig4Effectof2-MEonfibrosisandautophagy-relatedproteinsexpressionofdermalfibroblastafterexposuretohypoxiafor24h

低氧環境下的成纖維細胞自噬水平增高被認為是低氧誘發纖維化的另一重要機制。自噬是細胞利用自身衰老或損傷的細胞器和代謝廢物,進行物質再循環的過程[10]。自噬加快促使活化的成纖維細胞過度合成大量膠原。為了探究低氧條件下成纖維細胞自噬水平和纖維化的關系,我們檢測了低氧培養的成纖維細胞自噬相關蛋白的水平。

作為自噬的重要標志分子,LC3在細胞內有2種形式:LC3Ⅰ和LC3Ⅱ。LC3Ⅰ經過泛素化修飾后與自噬體膜表面的磷脂酰乙醇胺結合形成LC3Ⅱ,LC3Ⅱ是自噬小體形成的標志。P62是自噬降解的標志物,連接泛素化底物和LC3,最后P62和LC3Ⅱ在自噬溶酶體中一起被降解[11]。經典的自噬抑制劑Bafilomycin A1可抑制自噬小體和溶酶體的結合,自噬小體無法被降解,LC3Ⅱ不斷蓄積,同時P62也因無法被降解而含量升高[12]。我們研究發現,隨著低氧時間的延長,成纖維細胞表達LC3Ⅱ升高,表明低氧促進了皮膚成纖維細胞的自噬。加用Bafilomycin A1干預細胞自噬后,低氧培養的成纖維細胞過度合成的Ⅰ型膠原和CTGF明顯減少,這表明抑制自噬可以顯著阻斷成纖維細胞纖維化,有可能成為皮膚纖維化疾病的重要治療靶點。

2-ME是雌二醇的體內代謝產物,失去其雌激素前體的性激素活性,同時具有顯著的細胞調節活性[4]。我們曾發現2-ME可以抑制皮膚成纖維細胞活化[5],還有研究發現它通過抑制HIF-1α增強瘢痕疙瘩放療的效果[13],但2-ME對成纖維細胞自噬水平的影響尚不清楚。本研究采用2-ME干預低氧培養的成纖維細胞,發現其表達HIF-1α、CTGF和Ⅰ型膠原下降,且隨2-ME濃度的增高,這種抑制作用越加顯著,表明2-ME可抑制低氧導致的成纖維細胞纖維化。同時,在低氧條件下,2-ME處理的成纖維細胞LC3Ⅱ水平減低,LC3熒光減弱,P62水平增多,這提示2-ME可能通過抑制成纖維細胞自噬而阻斷低氧導致的纖維化,而且其對自噬作用的靶點很可能在經典自噬抑制劑Bafilomycin A1自噬作用靶點的上游,具體機制有待進一步研究。

綜上所述,低氧條件下皮膚成纖維細胞自噬水平增高并過度活化;2-ME可通過抑制低氧條件下成纖維細胞的自噬而阻斷纖維化,這為2-ME在皮膚纖維化疾病中的應用提供了新的理論依據。2-ME因不良反應小、不易產生耐藥性和口服耐受性好等優點而具有很好的臨床應用前景[14]。