一株具有抗菌活性芽孢桿菌HN-7的分離及抗菌活性研究

黃承敏，王蓉蓉，肖 茜，劉成國，周 輝*

（1.湖南農業大學 食品科技學院，湖南 長沙 410128；2.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128）

抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）是生物機體在抵御病原微生物的防御反應中所產生的一類抗微生物與一些惡性細胞的短肽。抗菌肽具有分子質量小、水溶性好、耐熱性強、無免疫原性、抗菌譜廣等特點，在食品加工過程中不易受到破壞，同時它又可生物降解生物吸收，因而安全性較高。因此，抗菌肽是一種天然安全的食品防腐劑[1]。芽孢桿菌屬（Bacillussp.）是繼乳酸菌后產抗菌肽研究比較普遍的一類細菌屬。目前，對于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）等產抗菌肽的研究在國內外已有很多報道。其中，蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）產生的抗菌肽有cerein 7B[2]、cerein 8A[3-5]、cerein MRX1[6]及—cerein 7[7]等。其中，cerein 7對牛鏈球菌（Streptococcus bovis）、鳥鏈球菌（Streptococcusavium）、耐萬古霉素（vancomycin-resistant）、馬鏈球菌（Streptococcus equines）、耐萬古霉素替考拉寧耐藥（vancomycin-resistant teicoplanin-resistant）、黃褐色微球菌（Micrococcus luteu）、單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、酪酸梭狀芽胞桿菌（Clostridium butyricum）等革蘭氏陽性菌都有很好的抑菌效果[8-10]；cerein 8A對單核細胞增生李斯特菌（L.monocytogenes）ATCC 7644、大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 25922和腸炎沙門菌（Salmonella enteritidis）ATCC13076 有很好的抑制作用[11-12]；cerein MRX1對表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）JCM 2414、牛鏈球菌（S.bovis）JCM5802、無毒李斯特菌（L.innocua）ATCC 3309、多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）CCM 1459等菌均有良好的抑制效果[13-15]。

單核細胞增生李斯特氏菌（L.monocytogenes）簡稱單增李斯特菌，是一種人畜共患病的病原菌。它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表現為敗血癥、腦膜炎和單核細胞增多。它廣泛存在于自然界中，食品中存在的單增李氏菌對人類的安全具有危險，該菌在4℃的環境中仍可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一，因此在食品衛生微生物檢驗中，必須加以重視。

基于此，本研究以單增李斯特氏菌（L.monocytogenes）54002為指示菌，從發酵豆制品中分離得到能夠抑制單增李斯特氏菌生長的目標菌株，并確定其抑菌物質的化學性質及生物活性，旨在尋找抑菌范圍廣、性能穩定且無毒害的抗菌肽，為開發新型抗菌肽及其在實際中的應用鑒定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與樣品

指示菌單增李斯特菌（L.monocytogenes）54002，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、類干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（E.coli）、藤黃微球菌（Micrococcus luteus）、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）：由本實驗室保存。湖南傳統發酵豆豉樣品：市售。

1.1.2 培養基

發酵培養基為MRS培養基（初始發酵培養基）、指示菌培養基為腦心浸液（brian heart infusion，BHI）液體培養基、BHI固體培養基：北京陸橋技術股份有限公司。

1.1.3 化學試劑

胃蛋白酶（酶活1200U/g）、胰蛋白酶（酶活50000U/g）、NaOH、HCl（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

DNP-9272BS-Ⅲ生化培養箱：上海新苗醫療器械制造有限公司；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；HH-8數顯恒溫水浴鍋：上海浦東物理光學儀器廠；LDZX-50 FBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；UV-1200紫外可見分光光度計：翱藝儀器（上海）有限公司；TGL-20M離心機：長沙英泰儀器有限公司；雷磁pHs-3C pH計：上海精科實業有限公司；ZWY-240恒溫培養振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的篩選

單核增生李斯特菌菌液制備：將活化過夜的單增李斯特菌按1%接種至50 mLBHI液體培養基中，37℃、150 r/min搖床培養至穩定期，備用。

產抗菌肽芽孢桿菌的初篩：取豆豉樣品約25.00g，加入225 mL的無菌生理鹽水中，充分振蕩后在80℃的水浴中保溫30 min，殺死營養細胞，然后制備系列稀釋溶液，選取合適稀釋度的稀釋液，移取0.1 mL涂布于BHI固體平板中，培養過夜。將單增李斯特菌菌液0.1 mL與100 mL溶化后并保持50℃左右的BHI半固體培養基進行混合，混勻后輕輕倒在長有芽孢桿菌菌落的BHI固體培養基上層，待培養基凝固后將平板繼續培養20 h，選取有抑菌圈的菌株，進行菌落的挑取，在BHI培養基平板上劃線純化、斜面保存。

1.3.2 復篩

參考O'CONNOR E B等[16]的方法：將單核增生李斯特菌菌液0.1 mL與100 mL溶化后并保持在50℃左右的BHI固體培養基進行混合，傾注平板，待培養基凝固后輕輕放置無菌牛津杯（內徑0.6 cm，外徑0.8 cm，高1.0 cm），在牛津杯中加入0.2 mL初篩菌的發酵上清液，4℃冰箱中擴散4 h以上，37℃培養12 h，觀察抑菌圈大小，測量抑菌圈直徑。

1.3.3 酶敏感性實驗

將篩選菌株HN-7發酵上清液分裝到2個10 mL Eppendorf管中，每管2.0 mL，調至各酶作用的最適pH值（胃蛋白酶最適pH值為2.0、胰蛋白酶最適pH值為8.0），分別在不同的管中加入胰蛋白酶、胃蛋白酶，使其終質量濃度為1mg/mL，37℃處理2 h，再調pH至7.0，進行抑菌實驗，對照為未經酶處理的pH7.0的菌株HN-7發酵上清液，比較抑菌圈差異。

1.3.4 熱穩定性實驗

將菌株HN-7發酵上清液pH調至7.0，分裝到8個1.5 mL Eppendorf管中，每管1.0mL，分別做如下處理：100℃、10min，100℃、30min，100℃、90min，121℃、10min，121℃、20min，進行抑菌實驗，對照為未作熱處理的pH 7.0的菌株HN-7發酵上清液，比較抑菌圈差異。

1.3.5 酸堿穩定性實驗

將菌株HN-7發酵上清液分裝到6個10 mL Eppendorf管中，每管2.0 mL，用1.2 mol/L NaOH溶液和1 mol/L HCl溶液，分別調pH至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0，37 ℃處理2 h，再調pH至7.0，進行抑菌實驗，對照為未作酸堿處理的pH 7.0的菌株HN-7發酵上清液，比較抑菌圈差異。

1.3.6 紫外線穩定性實驗

將菌株HN-7發酵上清液，調pH至7.0，分別在20 W紫外燈照射（照射距離10 cm）0.5～2.0 h，進行抑菌實驗，對照為未作紫外處理的pH 7.0的菌株HN-7發酵上清液，比較抑菌圈差異。

1.3.7 抗菌肽產量與細菌生長關系

在500 mL BHI液體培養基中以1%的接種量接入菌株HN-7在37℃培養。每隔3 h取發酵液，測定其在波長600 nm處的OD600nm值，并測定發酵液中抑菌圈直徑。通過發酵液中抑菌圈直徑的變化反映抗菌肽產量的變化。

1.3.8 抑菌譜

將菌株HN-7發酵上清液pH調至7.0，對金黃色葡萄球菌（G+）、大腸桿菌（G-）、藤黃微球菌（G+）、枯草芽孢桿菌（G+）、單增李斯特氏菌（G+）等指示菌做抑菌實驗，確定抑菌譜。

2 結果與分析

2.1 產抗菌肽芽孢桿菌的篩選

利用瓊脂擴散方法，從樣品中篩選出一株抑菌效果明顯（抑菌圈直徑＞牛津杯外徑0.8 cm）的芽孢桿菌（Bacillus sp.），命名為菌株HN-7。

2.2 酶敏感性實驗

將菌株HN-7的發酵上清液用胰蛋白酶和胃蛋白酶處理后，調節pH至7.0后，做抑菌實驗，結果見表1。

表1 菌株HN-7抗菌肽對酶的敏感性Table 1 Sensitivity of the antibacterial peptides of strain HN-7 to enzymes

由表1可知，未處理的發酵上清液抑菌效果明顯，用胰蛋白酶、胃蛋白酶處理后抑菌活性沒消失。胰蛋白酶、胃蛋白酶同屬于消化性蛋白酶，能將蛋白質分解成小分子氨基酸，菌株HN-7的發酵上清液在其處理后抑菌圈直徑減少，說明此發酵上清液中含有多肽，在胰蛋白酶、胃蛋白酶的作用下分解為氨基酸，結構的變化影響了抑菌活性，而胰蛋白酶抑菌圈直徑小于胃蛋白酶抑菌圈直徑，說明該上清液對胰蛋白酶更加敏感。實驗結果可推測發酵上清液中存在的抑菌物質是脂肽。

2.3 熱穩定性實驗

將菌株HN-7的發酵上清液pH調至7.0后，用不同的溫度處理不同的時間后做抑菌實驗，結果見圖1。

圖1 菌株HN-7抗菌肽的熱穩定性Fig.1 Thermos stability of the antibacterial peptides of strain HN-7

由圖1可知，菌株HN-7抗菌肽經121℃處理20 min仍具有很強的抑菌活性，抑菌圈直徑為1.7 mm，與對照相比僅相差0.1 mm。說明芽孢桿菌HN-7產高熱穩定性抗菌肽，這對于今后的工業化生產和食品加工應用將有重要意義。

2.4 酸堿穩定性實驗

取菌株HN-7的發酵上清液，用不同的酸堿度處理2 h后，調pH值至7.0，做抑菌實驗，結果見圖2。

圖2 菌株HN-7抗菌肽的酸堿穩定性Fig.2 pH stability of the antibacterial peptides of strain HN-7

由圖2可知，菌株HN-7抗菌肽在pH從2～12的范圍內抑菌效果較為穩定，在1.5～1.7 cm之間，與對照相比抑菌圈直徑僅降低0.1～0.3 cm，表明這種抗菌肽具有較好的酸堿穩定性。

大部分抗菌肽都是在酸性條件下穩定，有的抗菌肽在中性或堿性條件下即會失活。如應用廣泛的Nisin，在pH≤2.0的稀鹽酸中有高活性，但在pH 5.0時失活40%，pH 6.8時將喪失90%的活力[1]。而菌株HN-7抗菌肽，在酸性中性甚至堿性條件下都有活力，且抑菌活性較高，可滿足不同食品基質的酸堿要求，拓寬了它的應用范圍。

2.5 紫外線穩定性實驗

菌株HN-7對紫外線照射的穩定性試驗結果見表2。由表2可知，紫外線對菌株HN-7發酵上清液照射0.5～2.0 h，抗菌活性和未經紫外線處理的無明顯差別，與對照相比紫外線處理0.5 h抗菌活性沒有變化，紫外線照射處理2.0 h抗菌直徑僅降低0.1cm，說明紫外對芽孢桿菌HN-7所產抗菌肽的抗菌活性沒有影響。

表2 菌株HN-7抗菌肽對紫外線的穩定性Table 2 Ultraviolet stability of the antibacterial peptides of strain HN-7

2.6 抗菌肽產量與細菌生長關系

為了研究抗菌肽產量變化與細菌生長的關系，連續24h測定菌株HN-7菌的OD600nm值和其發酵液的抑菌圈直徑，結果見圖3。由圖3可知，菌株HN-7的發酵液中抑菌圈變化趨勢與細菌的OD600nm值變化基本相同。芽孢桿菌HN-7從3～12 h呈現直線增長，12～18 h緩慢生長，逐步達到穩定期，并在18 h抑菌圈達到最大值1.9 cm，18 h后菌株逐漸進入衰亡期，抑菌圈與OD600nm值都呈下降趨勢，因此可以確定菌株HN-7抗菌肽最佳收獲期為18 h。

圖3 菌株HN-7抗菌肽產量和菌株HN-7生物量的關系Fig.3 Relation of production of antibiotic lipopeptide and biomass of strain HN-7

2.7 抑菌譜的測定

表3 菌株HN-7抗菌肽的抑菌譜Table 3 Antimicrobial spectrum of antibacterial peptides of strain HN-7

由表3可知，菌株HN-7抗菌肽對植物乳桿菌、類干酪乳桿菌等乳酸菌沒有抑制作用，而對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌、單增李斯特氏菌都有的抑制效果，尤其是單增李斯特氏菌。如果抗菌肽作為一種食品防腐劑應用到食品中，在抑制腐敗及病原微生物的同時，而又不對食品中的有益菌不產生抑制作用，不僅可以提高抗菌肽的作用效率，同時又能保證食品的品質。

3 結論

本研究從湖南傳統發酵豆制品中，篩選出一株具有強抑菌能力的芽孢桿菌（Bacillussp.），經過蛋白酶酶解結合酸堿穩定性和熱穩定性等試驗，初步推斷該菌能產生抗菌肽。菌株HN-7所產抗菌肽在18 h的抑菌圈達到最大值（1.90 cm），pH 2.0～12.0、121℃處理20 min條件下仍有抑菌活性。該抗菌肽具有較廣的抑菌譜，不僅能抑制單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌等革蘭氏陽性菌，還能抑制大腸桿菌等革蘭氏陰性菌。較廣的抑菌譜與良好的熱穩定性和酸堿穩定性對于這種抗菌肽在食品加工中的應用具有重要意義。