產乳酸乙酯釀酒酵母菌株的構建

劉 港，李 潔，任津瑩，郭慶煥，趙 東，陳葉福*，郭學武，肖冬光

（1.天津科技大學 生物工程學院天津市工業微生物重點實驗室，天津 300457；2.中國輕工業濃香型白酒固態發酵重點實驗室，四川 宜賓 644000）

白酒的主要成分是酒精和水，約1%～2%為對白酒風味起主導作用的微量成分，其中酯類物質又占這些微量成分的60%～90%[1]。適宜的乳酸乙酯含量對中國白酒的風味和質量至關重要。清香型白酒酯類化合物中乳酸乙酯僅次于乙酸乙酯，而對于老白干香型白酒和米香型白酒來說，乳酸乙酯含量高于乙酸乙酯，其在老白干香型的比例為1.5～2.2∶1，米香型白酒的乳酸乙酯含量≥0.3g/L[2-4]。傳統白酒發酵過程中，通常以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作為發酵主體，結合環境和自然制曲提供的產酯前體乳酸菌等微生物產生乳酸等有機酸，并與乙醇發生酯化反應生成酯類物質來提高白酒品質[5]。隨著白酒工業的現代化發展，釀造技術的機械化越來越受到人們的關注，清潔生產和良好生產規范（good manufacturing practices，GMP）理念逐步在白酒行業應用，白酒行業將迎來重大的變革[6]。白酒生產機械化對一些傳統工藝提出了新的挑戰，同時意味著發酵過程中乳酸菌等微生物的帶入幾率下降，乳酸乙酯的生成量下降，嚴重影響白酒風味。因此，白酒機械化必須與發酵微生物的研發同步[7]。構建具有一定產乳酸進而生成乳酸乙酯能力的釀酒酵母菌株，不僅可以使發酵易于控制，而且可以增加乳酸乙酯的產量，彌補白酒的風味的不足，在特征飲料酒的釀造中大有用武之地。酵母改造產乳酸多應用于工業上聚乳酸生產，2003年COLOMBIé S等[8]將植物乳酸桿菌（Lactobacillus planetarium）的乳酸脫氫酶基因ldhL1整合到釀酒酵母基因組中，對發酵條件進行優化后重組菌株的L-乳酸產量達50g/L，為聚乳酸的生產提供大量的L-乳酸前體。2009年TOKUHIRO K等[9]在釀酒酵母中增加乳酸脫氫酶基因LDH的拷貝數至四拷貝，突變株的L-乳酸產量達74.1g/L，乳酸對葡萄糖的產率明顯提高，達0.69g/g。國內尚未見釀酒酵母過表達乳酸脫氫酶生產L-乳酸進而產乳酸乙酯應用于白酒工業的研究報道。

本研究利用同源重組[10-11]技術，用植物乳桿菌的乳酸脫氫酶基因ldhL1替換釀酒酵母丙酮酸脫羧酶基因PDC1獲得產L-乳酸進而生成乳酸乙酯的能力的重組菌株。并分別模擬液態白酒發酵和外源添加乳酸進行發酵，研究產乳酸菌株與出發株外源添加乳酸發酵產乳酸乙酯的差異。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質粒

實驗所用的菌株和質粒見表1。其中植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）用以乳酸脫氫酶基因ldhL1的擴增模板，pUG6質粒為篩選標記loxp-KanMX-loxp的擴增模板，pGAPza質粒用以篩選標記KanMX的丟除。

表1 菌株和質粒基因型以及來源Table 1 Genotype and sources of strains and plasmids

1.1.2 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養基：葡萄糖20.0 g/L，酵母粉10.0 g/L，蛋白胨20.0 g/L。

乳酸細菌培養基（MRS）：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5.0 g/L，檸檬酸氫二銨2.0 g/L，葡萄糖20 g/L，吐溫80 1.0mL/L，乙酸鈉5.0g/L，磷酸氫二鉀2.0g/L，硫酸鎂0.58g/L，硫酸錳0.25 g/L，調節pH至6.2～6.6。

LB（Luria-Bertani）培養基：葡萄糖10 g/L，酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L。

上述培養基配制固體培養基時加2%瓊脂，121℃滅菌15 min。

半乳糖誘導液態培養基：半乳糖20.0 g/L，蛋白胨20.0 g/L，酵母浸粉10.0 g/L，121℃滅菌15 min。

一級種子培養基和二級種子培養基分別由糖度為8°Bx和12°Bx的玉米水解液加5 mg/L的酵母浸粉構成；發酵培養基為糖度為18°Bx的玉米水解液加適量營養鹽組成。種子培養基及發酵培養基105℃滅菌15 min備用。

1.1.3 試劑

PrimeSTAR Max高保真脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶（2×）、rTaq聚合酶（5 U/μL）、DNA連接酶SolutionI（350 U/μL）、限制性內切酶XbaI（5 U/μL）和BamHI（5 U/μL）：大連寶生物工程有限公司；卡那霉素（kanamycin，Kan）：美國Amreco公司；遺傳霉素（G418）：美國Merck公司；耐高溫糖化酶（2×104U/mL）、液化酶（1×105U/mL）、酸性蛋白酶（1×105U/mL）：丹麥Novozymes公司。質粒提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒、切膠回收試劑盒：北京Solarbio科技有限公司。

1.2 儀器與設備

PCT-200聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）基因擴增儀、DYY-4c型電泳儀：美國BIO-RAD公司；AgilentGC7890氣相色譜儀（gas chromatography，GC）、Agilent 1100型高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）：美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 產乳酸乙酯菌株的構建

純種釀酒酵母自身沒有乳酸代謝的能力，不能進一步產乳酸乙酯。因此，本研究利用釀酒酵母PGK終止子和篩選標記KanMX，并用植物乳桿菌的乳酸脫氫酶基因ldhL1替換酵母的丙酮酸脫氫酶基因PDC1，以獲得一株產乳酸進而具有產乳酸乙酯能力的菌株。

（1）引物設計

根據GenBank報導的PDC1、ldhL1基因的核苷酸序列，本實驗所用到的PCR反應引物見表2。用Primer 5.0對引物進行設計，所有引物均由蘇州金唯智有限公司合成，酶切位點加下劃線表示。

表2 PCR引物及序列Table 2 PCR primers and their sequences

注：“U”表示上游引物，“D”表示下游引物。

（2）DNA提取及純化

基因組DNA提取及DNA純化回收參見文獻[12]；質粒提取方法參見文獻[13]。

（3）重組質粒Yep352-PK的構建

以出發菌株AY12-α的基因組和質粒pUG6作為模板，分別擴增得到終止子PGK1T和篩選標記KanMX片段，將純化的PGK1T和KanMX片段融合，得到融合片段PGK1T-KanMX。將純化的PGK1T-KanMX片段和Yep352質粒分別用XbaI和BamHI酶切，回收后進行連接得到重組質粒Yep352-PK。構建的質粒Yep352-PK用以帶乳酸脫氫酶基因IdhL1和下同源臂側翼序列的PGK1T-KanMX片段的大量擴增，構建過程見圖1。

圖1 重組質粒Yep352-PK的構建Fig.1 Construction of recombinant plasmid Yep352-PK

（4）醋酸鋰化學轉化[14]與重組菌株的鑒定

以釀酒酵母AY12-α的基因組作為模板，PCR擴增得到啟動子兼上同源臂的PA及下同源臂PB片段；以植物乳桿菌的基因組作為模板，PCR擴增得到乳酸脫氫酶基因ldhL1片段；以質粒Yep352-PK作為模板，PCR擴增得到PGK1TKanMX片段。將純化的片段：PA、ldhL1、PGK1T-KanMX和PB利用醋酸鋰化學轉化法導入酵母細胞AY12-α中。轉化后的細胞涂布于終濃度為300 μg/mL G418的YEPD培養基上進行篩選，挑取轉化子，提取基因組進行PCR驗證。

（5）轉化子篩選標記的去除

用醋酸鋰化學轉化法將PGAPza質粒導入突變株中，通過Cre-Lxop系統將整合到基因組上的抗性基因KanMX去除。

1.3.2 生長曲線繪制

分別從斜面上挑取1環菌株AY12-α和P接種于5 mL YEPD液體培養基中，30℃、180 r/min培養12 h。每隔1 h取相應量的活化菌體接入對應體積的新鮮YEPD液體培養基中，以不加菌液的空白培養基作為對照，在生長曲線測定儀中測定其波長600 nm處的吸光度值。以培養時間為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制菌株AY12-α和P生長曲線。

1.3.3 乳酸耐受性實驗

從斜面刮取一環AY12-α菌株接種于5 mL的YEPD液體培養基中，30℃、180r/min過夜培養，高速離心收集菌體，并用無菌水洗兩次。測定菌液的濃度并調節菌液的OD600nm值為1.0，同時對菌液進行10倍梯度稀釋，依次取2 μL分別點滴于添加有1.0%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、6.0%乳酸的YEPD平板上，30℃靜置培養2～3d，觀察菌落形態。

1.3.4 發酵性能測定

（1）玉米液態白酒發酵：分別從4℃保藏的固體斜面挑取1環出發菌株AY12-α和重組菌株P接入裝有5 mL一級種子玉米水解液培養基中，30℃靜置培養至穩定期（約24 h）。將一級培養物全部轉入裝有45 mL二級種子玉米水解液培養基中，30℃靜置培養16 h，測定菌液的OD600nm值，取相應的體積換算成相同的菌體數量接種到配制好的135 mL發酵培養基中。30℃培養箱靜置發酵，每隔12 h稱質量一次，發酵結束后分別測定CO2總質量損失、乙醇、乳酸、還原糖及酯類含量。

（2）外源添加乳酸發酵實驗：一、二級種子的培養與（1）中一致，依據出發菌株AY12-α對乳酸的耐受性，確定乳酸的添加濃度，在發酵培養基中添加相應濃度的乳酸進行發酵。30℃培養箱靜置發酵，每隔12 h稱質量一次，發酵結束后分別測定CO2總質量損失、酒精度、還原糖及酯類含量。

1.3.5 測定方法

（1）CO2總質量損失、還原糖含量、酒精度測定：按照參考文獻[15]的方法進行。

（2）乳酸含量的測定

采用高效液相色譜法（HPLC）測定發酵液中乳酸的含量。HPLC的檢測條件：HPX-87H色譜柱（300mm×7.8mm），流動相為5 mmol/L稀硫酸，流動相流速為0.6 mL/min，柱溫65℃，檢測器溫度45℃，采用示差折光檢測器檢測。用流動相對樣品進行稀釋后，用0.22 μm的濾膜進行過濾，采用外標法對發酵液進行定量。制作標準曲線的標準偏差達0.999以上方可用于數據的分析。

（3）酯類含量的測定

氣相色譜法：根據利用氣相色譜檢測白酒的文獻[16]，氣相色譜儀條件：AT.LZP-930白酒專用色譜柱（50 m×320 μm×1 μm）；火焰離子化檢測器（flame ionization detector，FID），檢測器溫度200 ℃；載氣為高純氮（N2），流速5 mL/min；檢測條件：程序升溫，50℃保持8 min，5℃/min升至120℃，保持8 min；進樣口溫度200℃；進樣量1.0 μL；分流比為10∶1。

2 結果與分析

2.1 產乳酸菌株的構建及鑒定

2.1.1 重組質粒Yep352-PK的構建

使用1.3.1的方法，構建表達質粒Yep352-PK。對構建的Yep352-PK質粒進行PCR驗證，其結果如圖2所示。

圖2 重組質粒Yep352-PK的PCR擴增結果Fig.2 Results of PCR amplification of recombiant plasmid Yep352-PK

由圖2可知，以Yep352-PK為模板，擴增得到1 871 bp的PGK1T-KanMX片段、258 bp的PGK1T片段和1 613 bp的KanMX片段。PCR驗證結果與理論預期相符，說明PGK1TKanMX基因片段成功插入Yep352的多克隆位點處，Yep352-PK質粒構建成功。

2.1.2 過表達ldhL1重組菌株的構建

將轉化片段PA、ldhL1、PGK1T-KanMX和PB用醋酸鋰化學轉化法導入酵母細胞AY12-α中。通過PA和PB片段與酵母基因組上PDC1基因兩側的同源序列發生同源重組，從而實現了ldhL1基因的過表達盒整合到釀酒酵母染色體上，同源重組過程如圖3所示。

圖3 轉化片段的重組過程Fig.3 Homologous recombination process of converted fragments

在上同源臂PA上游設計引物P1-U，結合ldhL1-D以驗證上游片段的整合；設計引物ldhL1-U/Kr-D以驗證中游片段的整合；在下同源臂PB下游設計引物P2-D，結合Kr-U以驗證下游片段的整合。PCR擴增結果用0.8%瓊脂糖凝膠電泳結果見圖4。

圖4 不同引物的PCR擴增結果Fig.4 Results of PCR amplification using different primers

由圖4可知，提取轉化子的基因組作為模板進行PCR驗證，上游引物P1-U/ldhL1-D的PCR產物可看到一條2 800 bp左右的特異性條帶；中游引物ldhL1-U/Kr-D的PCR產物經0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，可看到一條2 900 bp左右的特異性條帶；下游引物Kr-U/P2-D的PCR產物經0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，可看到一條4 000 bp左右的特異性條帶，出發菌株AY12-α型單倍體的陰性對照無條帶，說明重組盒PA-ldhL1-PGK1T-KanMX-PB片段已成功重組到釀酒酵母AY12-α基因組中，并且重組位置也正確。

2.1.3 轉化子篩選標記的去除

去掉突變株基因組上的KanMX抗性基因后，得到遺傳霉素抗性丟失的重組菌株P并進行后續實驗。

2.2 重組菌株P的生長性能測定

出發菌株AY12-α和重組菌株P的生長曲線測定結果見圖5。

圖5 出發菌株AY12-α和重組菌株P生長性能的比較Fig.5 Comparison of growth performance of original strain AY12-α and recombinant strain P

從圖5可以看出，與出發菌株AY12-α相比，重組菌株P的整體生長趨勢與出發菌株基本保持一致（P＜0.05），生物量最終能夠達到與出發菌株AY12-α相同的水平，到達穩定期時重組菌株P的生物量略低。結合發酵實驗確定乳酸產生，結果表明，重組菌株P代謝產生的乳酸對菌株的生長基本沒有影響。

2.3 重組菌株P的基本發酵性能測定

將親本AY12-α與重組菌株P同時進行玉米水解液發酵。發酵結束后測定各菌株的基本發酵性能，結果見表3。

表3 出發菌株AY12-α和重組菌株P的發酵性能比較Table 3 Comparison of fermentation performance of original strain AY12-α and recombinant strain P

由表3可知，過表達ldhL1基因的重組菌株P與出發菌株AY12-α在相同條件下CO2總質量損失、還原糖含量等主要發酵性能沒有明顯變化（P＜0.05），乙醇產量稍有降低但不是很明顯（P＞0.05），表明過表達ldhL1基因對菌株的發酵性能沒有太大影響。

同時，過表達ldhL1基因的重組菌株P的L-乳酸產量達12.64 g/L，而乙醇的產量有所降低，這是由于乳酸脫氫酶代謝途徑的引入，使得糖酵解產生的丙酮酸在厭氧發酵過程中部分分流流向了L-乳酸。最大理論值為每克葡萄糖發酵產生0.51g乙醇，最大理論值為每克葡萄糖發酵產生1.0 g乳酸，實驗測得發酵培養基的葡萄糖含量為172.30 g/L，親本菌株AY12-α和重組菌株P的乙醇對葡萄糖產率分別為0.47 g/g和0.42 g/g，乙醇產率結果差異不顯著（P＞0.05），同時重組菌株P的L-乳酸對剩余葡萄糖產率為0.41 g/g。實驗結果支持了COLOMBIE S等[18]在釀酒酵母中整合過表達植物乳桿菌ldhL1基因可以達到積累L-乳酸的結論。

2.4 產乳酸菌株與外源添加乳酸發酵產乳酸乙酯的差異

為了比較出發菌株AY12-α與重組菌株P對乳酸的利用能力，在出發菌株AY12-α可以耐受乳酸的濃度范圍下對其進行了添加乳酸的發酵實驗。由前述可知重組菌株P的乳酸產量達12 g/L，為不加乳酸發酵的陰性對照。

2.4.1 乳酸添加量的確定

用無菌水調節菌液濃度為OD600nm=1.0，10倍梯度稀釋，依次取2 μL分別點滴于添加1.0%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、6.0%乳酸的YEPD平板。結果如圖6所示。

圖6 出發菌株AY12-α的乳酸耐受性Fig.6 Lactic acid tolerance of original strain AY12-α

由圖6可知，乳酸添加量為1.0%～3.0%時，菌株AY12-α的菌落形態正常，基本不影響菌體的生長；當乳酸添加量提高至3.5%時，菌濃較低時菌落形態明顯發生變化，因此菌株AY12-α對乳酸的耐受濃度為3.5%。因此添加與產乳酸菌株相同水平的乳酸（添加量為1.0%，質量濃度為12g/L）基本不會影響菌株的生長。

2.4.2 添加乳酸發酵性能比較

以不加乳酸的出發菌株AY12-α和重組菌株P作為對照，對出發株AY12-α添加12g/L的乳酸進行發酵實驗。發酵結束后測定各菌株的基本發酵性能，結果見表4。

由表4可知，添加12 g/L的乳酸進行發酵，與重組菌株P的CO2總質量損失和乙醇產量差異不顯著（P＞0.05），說明乳酸的添加沒有明顯影響酵母菌株的生長。同時，發酵液中菌株AY12-α的乳酸含量基本保持不變，表明外源添加的乳酸大部分以游離的形式存在。

表4 添加乳酸后發酵性能比較Table 4 Comparison of fermentation performance after adding lactic acid

表5 添加乳酸對高級醇和酯含量的影響Table 5 Effect of adding lactic acid on the contents of higher alcohols and esters mg/L

由表5可知，產乳酸的重組菌株P其乳酸乙酯產量為162.75 mg/L，乳酸到乳酸乙酯的轉化率為1.04%；菌株AY12-α不添加乳酸進行發酵檢測不到乳酸乙酯的產生；添加與重組菌株P產量相同的乳酸含量（12 g/L），出發株AY12-α的乳酸乙酯產量達115.47 mg/L，僅為產乳酸菌株P的71%，結果差異顯著（P＜0.05），表明重組菌株P胞內乳酸較胞外添加乳酸對乳酸乙酯的合成更具優勢。結果表明過表達ldhL1基因使發酵的代謝流由乙醇部分流向了L-乳酸，胞內產生的L-乳酸作為一種次級代謝產物，在酵母的胞內發生化學反應生成乳酸乙酯。釀酒酵母本身對乳酸具有一定的化學作用，但是這種效果較自身產乳酸的重組菌株P低，這可能是由于外源乳酸進入胞內部分被細胞膜所阻礙，胞內自身產生的乳酸濃度高且更容易被胞內酶所催化使重組菌株P的乳酸乙酯含量較高。同時重組菌株P的總高級醇（正丙醇、異丁醇、異戊醇和苯乙醇）的含量降低至118.11 mg/L，而出發菌AY12-α的總高級醇含量為225.79 mg/L，降低了約47.7%。

3 結論

與添加相同濃度乳酸的出發菌株AY12-α發酵相比，實驗得到產L-乳酸酵母菌株，其乳酸乙酯的產量明顯提高（P＜0.05），達162.75mg/L。可以進一步結合啟動子工程，代謝工程等操作技術，進一步協調乳酸與乙醇、乳酸與乳酸乙酯的比例，為米香型白酒機械化生產技術革新提供了一種新型酵母菌，有效避免窖泥微生物代謝產生的異味物質對白酒風味不利的影響。

產乳酸酵母的構建也為進一步提高乳酸乙酯產量奠定了物質基礎，由此可以進一步構建乳酸到乳酸乙酯的酶催化反應通路，得到高產乳酸乙酯酵母菌株以用于白酒工業生產。