蕎麥釀造酒中黃酮類物質含量變化的初步研究

曹 冉，鐘繼仁，張曉龍，朱文眾*

（1.河北科技大學 生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018；2.承德康熙酒業有限公司，河北 承德 068253）

蕎麥為蓼科（Polygonum）蕎麥屬（Fagopyrum）一年生的草本植物，因其子實呈三棱卵圓形，又稱三角米[1]。蕎麥的種植歷史悠久，在我國分布廣泛，種植的蕎麥主要分為甜蕎（Fagopyrum esculeutummoench）和苦蕎（Fagopyrum tataricumgaench）。蕎麥具有很高的營養價值，含有大量碳水化合物、蛋白質、維生素和礦物質等，營養物質種類豐富，含量平衡[2-3]。蕎麥也有其獨特的食療作用[4]，被廣泛應用于食品等領域，如蕎麥酒、蕎麥茶、蕎麥醋、蕎麥掛面和蕎麥藥品等。

蕎麥中含有大量黃酮類物質，蘆丁是黃酮類化合物的主要物質，研究表明，甜蕎中蘆丁含量一般在0.02%～0.80%，苦蕎中蘆丁含量一般在1.08%～6.60%，還有少量槲皮素、異槲皮素等6種化合物存在[5-6]。黃酮類化合物有很高的藥用價值，能降低膽固醇、血脂，改變血管的通透性，防治高血壓冠心病等疾病，還具有強烈的抗氧化性，能預防炎癥和癌癥[7-9]。黃酮類物質易溶于乙醇等有機溶劑，因此蕎麥釀酒過程中隨著酒精的產生，黃酮類物質溶解度也會隨之提高，使蕎麥酒具有營養保健功能[10]。國內已有對于蕎麥釀造酒的研究，馮耐紅[11]采用現代與傳統相結合的工藝釀造糜米苦蕎黃酒，李園園[12]采用響應面法優化苦蕎發酵酒發酵參數并且對貯存期間苦蕎發酵酒相關成分的變化進行了質量分析。但是蕎麥釀酒大多數以苦蕎為發酵原料，對于甜蕎釀酒的研究較少。

蕎麥的分布具有地域性，苦蕎的主要產區以西南各省區為主，華北各省區以甜蕎為主，為了提高本地區的蕎麥利用價值，本實驗采用甜蕎作為發酵原料。采用液態發酵法[12-14]，通過單因素試驗以及正交優化試驗確定蕎麥釀造酒的最佳工藝條件，將醇溶性黃酮類物質更多的溶解在酒體中，提高蕎麥釀造酒的營養價值。最終得到口感好，風味佳，營養價值高的甜蕎釀造酒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

蕎麥粉：由承德康熙酒業有限公司提供。

1.1.2 主要試劑

無水乙醇（分析純）：天津市光復科技發展有限公司；氫氧化鈉（分析純）、硝酸鋁（分析純）：天津市永大化學試劑有限公司；α-淀粉酶（酶活3 700 U/g）：北京奧博星生物技術有限責任公司；蘆丁標準品（純度＞98%）：北京索萊寶科技有限公司；亞硝酸鈉（分析純）：天津市北方化玻購銷中心；釀酒曲（紹酒風味）：安琪酵母股份有限公司。

1.2 儀器與設備

7200分光光度計：上海天美科學儀器有限公司；PL203電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；YXQ-LS-18SI滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；LRH-150B生化培養箱：廣東省醫療器械廠；LXJ-IIB離心機：上海安亭科學儀器廠；25mL附溫比重瓶：上海信誼儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 蕎麥酒釀造工藝流程及操作要點

操作要點：

液化：取100 g蕎麥粉，按比例加入一定量蒸餾水，然后加入1%的α-淀粉酶，70℃水浴15 min。

糊化醪：經液化處理后，繼續在120℃條件下糊化30 min，糊化后冷卻至常溫。

發酵：糊化醪中加入不同量的釀酒曲，在20℃恒溫培養箱中發酵12 d。

固液分離：發酵好的酒樣裝入離心杯中，5 000 r/min離心10 min，收集即得蕎麥酒原液。

1.3.2 分析檢測

3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）比色法[15]測定蕎麥粉中淀粉的含量；酒精度的測定采用GBT15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中密度瓶法[16]；黃酮類物質的含量測定采用紫外分光光度計法[17]。

葡萄糖標準曲線的繪制：配制0.1%的葡萄糖標準溶液，取0、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL葡萄糖標準溶液置于7支試管中，加入0.1 g/mL的檸檬酸緩沖液至2 mL，再加入1.5 mL DNS試劑，至沸水中加熱5 min，取出冷卻至室溫加入21.5mL蒸餾水，在波長540 nm條件下測定吸光度值。以葡萄糖標準溶液質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標繪制葡萄糖標準曲線。

蘆丁標準曲線的繪制：配制0.2 mg/mL的蘆丁標準溶液，分別吸取0、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL蘆丁標準溶液置于6支試管中，加入體積分數為30%乙醇至5mL，加5%的NaNO2溶液0.3 mL搖勻靜置5 min，加10%的Al（NO3）3溶液0.3 mL搖勻靜置5 min，加入4%的NaOH溶液2.0mL，體積分數為30%乙醇溶液2.4mL搖勻靜置10min。在波長500 nm條件下測定吸光度值。以蘆丁標準溶液質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標繪制蘆丁標準曲線。

1.3.3 發酵工藝優化單因素試驗設計

（1）料水比：蕎麥粉100 g，按照1∶2.0、1∶2.5、1∶3.0、1∶3.5、1∶4.0（g∶mL）的料水比添加蒸餾水，0.8%釀酒曲，20 ℃發酵10 d，測定酒精度和黃酮類物質含量。

（2）加曲量：蕎麥粉100 g，料水比1∶2.5（g∶mL），按照0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的比例添加釀酒曲，20℃發酵10 d，測定酒精度和黃酮類物質含量。

（3）發酵時間：取蕎麥粉100 g，料水比1∶2.5（g∶mL），0.6%釀酒曲，20 ℃發酵6 d、8 d、10 d、12 d、14 d，測定酒精度和黃酮類物質含量。

（4）發酵溫度：取蕎麥粉100 g，料水比1∶2.5（g∶mL），0.6%釀酒曲，15℃、20℃、25℃、30℃發酵10 d，測定酒精度和黃酮類物質含量。

1.3.4 發酵工藝優化正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上，分別對料水比（A），加曲量（B），發酵時間（C）三個發酵條件進行正交試驗優化，以蕎麥酒的酒精度和黃酮類物質收率作為雙重評價指標，最終確定出最佳的發酵工藝。正交試驗因素與水平見表1。

表1 發酵工藝優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation process optimization

1.3.5 發酵過程中黃酮類物質含量的變化

在正交優化結果中選取最佳的發酵條件進行釀酒，并且每天測定黃酮類物質的含量。糊化后冷卻至常溫的糊化液作為0時，以后每隔24 h測定，探討發酵過程中黃酮類物質的變化。

1.3.6 蕎麥釀造酒參數的計算

蕎麥釀造酒的淀粉利用率及黃酮類物質收率計算公式如下：

2 結果與分析

2.1 蕎麥粉中淀粉含量的測定

以葡萄糖標準溶液質量濃度C（x，g/L）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標繪制還原糖標準曲線，結果見圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

由圖1可知，葡萄糖標準曲線的回歸方程為：y=0.6095x，相關系數R2=0.9918，表明二者線性關系良好。按照葡萄糖標準曲線的回歸方程測得蕎麥粉中淀粉含量為67.50%。

2.2 蕎麥粉中黃酮類物質含量的測定

以蘆丁標準溶液質量濃度C（x，g/L）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標繪制蘆丁標準曲線，結果見圖2。

圖2 蘆丁標準曲線Fig.2 Standard curve of rutin

由圖2可知，蘆丁標準曲線的回歸方程為：y=9.022x-0.004，相關系數R2=0.992 4，表明二者線性關系良好。按照蘆丁標準曲線的回歸方程測得蕎麥粉中黃酮類物質含量為0.035%。

2.3 發酵工藝優化單因素試驗結果

2.3.1 料水比對酒精度和黃酮類物質收率的影響

圖3 料水比對酒精度和黃酮類物質收率的影響Fig.3 Effect of material and water ratio on alcohol content and flavonoids yield

由圖3可知，蕎麥釀造酒的酒精度隨著料水比在1∶2.0～1∶4.0（g∶mL）范圍內的增加由13.02%vol下降至9.54%vol。蕎麥中淀粉充分水解得到還原糖，還原糖再轉化生成酒精的總量是基本相同的，因此隨著料水比的增加，酒精度呈現了下降的趨勢。黃酮類物質的收率呈現了先上升后下降的趨勢，在料水比1∶2.5（g∶mL）時到達最高，為48.66%。因此，選擇料水比為1∶2.5（g∶mL）。

2.3.2 釀酒曲添加量對酒精度和黃酮類物質收率的影響

圖4 釀酒曲添加量對酒精度和黃酮類物質收率的影響Fig.4 Effect of the distilled's yeast addition on alcohol content and flavonoids yield

由圖4可知，蕎麥釀造酒的酒精度是先隨著釀酒曲的添加量在0.2%～0.8%范圍內增加而增加，并在釀酒曲添加量為0.8%時，酒精度達到最大值，為14.79%vol，隨后釀酒曲添加量＞0.8%，酒精度呈現下降趨勢。釀酒曲添加過少，導致發酵不完全，所以酒精度過低，添加量過多，發酵過快，釀酒曲中微生物的生長也會消耗一部分還原糖，并產生代謝產物，導致酒精度也有所下降。黃酮類物質收率也是呈現了先增加后減少的趨勢，在酒曲添加量為0.6%時達到最大值，為47.66%，隨后釀酒曲添加量＞0.6%，黃酮類物質收率呈現下降趨勢。因此，選擇釀酒曲添加量為0.6%。

2.3.3 發酵時間對酒精度和黃酮類物質收率的影響

圖5 發酵時間對酒精度和黃酮類物質收率的影響Fig.5 Effect of fermentation time on alcohol content andflavonoids yield

由圖5可知，蕎麥釀造酒的酒精度和黃酮類物質收率都是先隨著發酵時間在6～10 d范圍內的增加而增加，在發酵時間為10 d時，二者都達到最大值，分別為13.04%vol和47.86%，隨后當發酵時間＞10 d，酒精度和黃酮類物質收率都呈現下降趨勢。發酵時間過久，還原糖大部分被消耗，釀酒曲中的微生物開始衰亡，轉化酒精的能力下降，產生有害代謝產物，導致了酒精度下降。黃酮類物質易溶于乙醇等有機溶劑中，和酒精度呈現相同的升降趨勢。因此，選擇發酵時間10 d。

2.3.4 發酵溫度對酒精度和黃酮類物質收率的影響

圖6 發酵溫度對酒精度和黃酮類物質收率的影響Fig.6 Effect of fermentation temperature on alcohol content and flavonoids yield

由圖6可知，蕎麥釀造酒的酒精度和黃酮類物質收率隨著發酵溫度在15～20℃范圍內的增加而增加，在20℃時，酒精度和黃酮類物質收率達到最大值，分別13.12%vol和48.30%，隨后當發酵溫度＞20℃之后，酒精度有所下降，黃酮類物質收率呈現先下降后上升的趨勢。發酵溫度太低釀酒曲中的微生物活性低，還原糖轉化的酒精過少。發酵溫度太高發酵過快，釀酒曲的微生物提前進去衰亡期，副產物增加，導致酒精度降低。因此，選擇發酵溫度為20℃。

2.4 發酵工藝優化正交試驗結果

在上述單因素試驗的基礎上，選取料水比（A）、釀酒曲添加量（B）和發酵時間（C）3個因素進行正交優化試驗，基于對釀造酒風味形成和工廠大規模生產應用的考慮，發酵溫度選定20℃。正交試驗結果與分析見表2，方差分析分別見表3和表4。

表2 發酵工藝正交試驗優化結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation process optimization

表3 以酒精度為評價指標的正交試驗結果與方差分析Table 3 Results and variance analysis of orthogonal tests using alcohol content as evaluation index

表4 以黃酮類物質收率為評價指標的正交試驗結果與方差分析Table 4 Results and variance analysis of orthogonal tests using flavonoids yield as evaluation index

由表2可知，根據R值的大小可以看出，影響蕎麥酒酒精度的因素由主到次為料水比＞釀酒曲添加量＞發酵時間，最佳發酵條件組合為A1B3C2；影響蕎麥酒黃酮類物質收率的因素由主到次為料水比＞發酵時間＞釀酒曲添加量，最佳發酵條件組合為A3B2C3。由表3可知，以酒精度為評價指標，料水比、釀酒曲添加量和發酵時間對酒精度均未有顯著影響（P＞0.05）。由表4可知，以黃酮類物質收率為評價指標，料水比、釀酒曲添加量和發酵時間對黃酮類物質收率均未有顯著影響（P＞0.05）。綜合考慮確定最佳發酵條件組合為A3B2C3，即料水比1∶3（g∶mL），釀酒曲添加量0.6%，發酵時間12 d，發酵溫度20℃，在此發酵條件下進行驗證試驗，蕎麥酒酒精度和黃酮類物質收率分別為10.09%vol和57.36%。

2.5 發酵過程中黃酮類物質收率的變化

圖7 發酵過程中黃酮類物質收率的變化Fig.7 Changes of flavonoids yield during the fermentation process

由圖7可知，在發酵過程中黃酮類物質收率在2～6 d時有明顯的增加，第6天后增加緩慢，在8～14 d黃酮類物質收率趨于穩定，12 d后略有下降。分析原因可能是黃酮類物質易溶于乙醇等有機溶劑，在2～6 d時發酵醪分層，開始產生酒精，上清液中黃酮類物質收率也明顯的上升。6～8 d還原糖轉化酒精速度減慢，酒精度增加減緩，上清液中黃酮類物質收率增加速度也減慢。8～14d乙醇反饋抑制作用增強，黃酮類物質收率也趨于穩定。

3 結論

本試驗以甜蕎作為釀酒原料，用紹興風味的黃酒釀酒曲，采用液態發酵法進行發酵。通過對料水比、釀酒曲添加量、發酵時間和發酵溫度四項單因素試驗研究，在單因素試驗基礎上進行正交優化，得到最佳發酵工藝。結果表明，最佳發酵工藝為料水比1∶3（g∶mL），釀酒曲添加量0.6%，發酵時間12 d，發酵溫度20℃。在最佳發酵工藝條件下，蕎麥釀造酒酒精度10.09%vol，黃酮類物質收率57.36%。酒體澄清，呈現棕黃色，有焦香味但略顯單薄，可在后續研究中完善。