高還原力及脂肪酶酶活櫻桃酵素生產工藝優化

張 冰，張會娟，張全盛，布文昊，朱瑞艷，劉志偉，朱海洋，高大威*

（1.燕山大學 環境與化學工程學院，河北 秦皇島 066004；2.秦皇島櫻韻酒業有限公司，河北 秦皇島 066200）

酵素是指植物經深層發酵，提取的一種含生物活性物質的低鹽液體。其不僅含有植物本身的營養物質、發酵所得的酶及還原性物質，還可影響服用者體內的活性酶系，從細胞層面調節機體的生命活動[1]，從而具有抗癌、降血壓、整腸、消除便秘、抵御痛風、減肥、抗過敏等的功效[2]。脂肪酶是一類特殊的酯鍵水解酶[3]，是膳食脂肪消化的主要酶，其表達的改變與肥胖等代謝性疾病有著密切的關系，是治療肥胖等代謝性疾病的靶點[4]。還原性是指在化學反應中原子、分子或離子失去電子的能力。還原性物質與其他物質在一起時，可以保護其他物質免受氧化，具有抗氧化作用。還原性物質對人的生長、代謝及免疫皆有益。

現代醫學研究表明，櫻桃富含多種重要的天然保健功能成分，具有顯著的抗病保健功效，因此櫻桃保健價值的研究也日趨增多[5-6]。由于夏季氣溫高，櫻桃不易保存，冷藏容易導致果實破裂，而且存儲時間較短；冷凍處理后，雖能延長保存時間，但解凍后櫻桃質地會有較大變化。因此本試驗將櫻桃制成櫻桃酵素，并采用單因素及正交試驗優化櫻桃酵素的發酵條件，以期可以延伸櫻桃產業鏈，增加櫻桃產業的附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山海關本地大櫻桃、白砂糖：市售；VL2酵母：天津盛豐商貿有限公司；復合酶（果膠酶∶纖維素酶=1∶1，酶活50 000 U/g）：廣西南寧龐博生物工程有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

HH-4恒溫水浴鍋、HN-25S恒溫培養箱：邦西儀器科技上海有限公司；721紫外可見光分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；JM-BL電子天平：余姚市紀銘稱重校檢設備有限公司；18L高壓蒸汽滅菌鍋：浙江新豐醫療器械有限公司；78-1磁力攪拌器：江蘇金壇科技儀器有限公司；PHS-3C pH計：上海越平科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 櫻桃酵素的制備

準確稱取VL2酵母菌種0.1 g，加入0.05 g/mL的糖水10 mL，40℃水浴活化酵母30 min。過濾后的櫻桃果漿添加一定量的復合酶，50℃水浴3 h酶解。酶解后的櫻桃果漿添加一定量的白砂糖，接種一定量活化后的酵母，于培養箱中一定溫度條件下發酵一定時間。

1.3.2 單因素試驗

分別設定酵母接種量為5%、10%、15%、20%、25%；加糖量（櫻桃果漿∶白砂糖質量比）為2∶1、3∶1、4∶1、5∶1；復合酶添加量為200 U/g、300 U/g、400 U/g、500 U/g、600 U/g；發酵時間為2 d、3 d、4 d、5 d、6 d；發酵溫度為25℃、30℃、34℃、37 ℃；發酵初始pH為3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0。采用單一變量控制法進行試驗，發酵后對分組樣品脂肪酶活性和還原力水平進行測定[8-10]。

1.3.3 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選擇發酵時間（A）、加糖量（櫻桃果漿∶白砂糖質量比）（B）、復合酶添加量（C）、接種量（D）為正交試驗的4個因素，每個因素設置3個水平，以脂肪酶酶活和還原力為考察指標進行L9（34）正交試驗，正交試驗因素與水平見表1。

表1 櫻桃酵素發酵工藝優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for cheery enzyme fermentation process optimization

1.3.4 測定方法

脂肪酶活力：按照參考文獻[11-12]的方法測定脂肪酶活力。酶活力單位定義為在一定條件下，每分鐘釋放出1 μmol脂肪酸的酶量定義為1個脂肪酶酶活力單位（U）。脂肪酶酶活力的計算公式如下：

式中：X為脂肪酶酶活力，U/mL；c為脂肪酸濃度，μmol/mL；V為脂肪酸溶液的體積，mL；t為作用時間，min；V1為酶液用量，mL。

還原力：按照參考文獻[13]的方法進行測定。將測定的吸光度值與標準維生素C（vitamin C，VC）溶液吸光度值對照，樣品的吸光度值越大，說明樣品還原力越強。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 發酵時間對櫻桃酵素發酵的影響

由圖1可知，櫻桃酵素脂肪酶酶活隨發酵時間的延長呈先上升后下降的趨勢；發酵第5天時脂肪酶酶活達到最高，為902 U/mL。還原力在發酵2～3 d時迅速升高，3～5 d增速減緩，5 d后開始迅速下降，發酵第5天時酵素的還原力吸光度值為1.158，相當于2.25 mg/mL VC標準溶液。綜合考慮脂肪酶酶活及還原力，選取發酵時間為4 d。

圖1 發酵時間對櫻桃酵素發酵的影響Fig.1 Effect of fermentation time on cheery enzyme fermentation

2.1.2 加糖量對櫻桃酵素發酵的影響

圖2 加糖量對櫻桃酵素發酵的影響Fig.2 Effect of sugar addition on cheery enzyme fermentation

由圖2可知，櫻桃酵素脂肪酶酶活隨加糖量的減小呈先上升后下降的趨勢；加糖量（櫻桃果漿∶白砂糖質量比）為5∶1時脂肪酶酶活達到最高，為930 U/mL。還原力在加糖量為2∶1～3∶1呈上升趨勢且3∶1時達到最高，之后逐漸降低，加糖量為3∶1時還原力吸光度值為1.003，相當于1.95 mg/mLVC標準溶液。綜合參考脂肪酶酶活及還原力，選取櫻桃果漿與白砂糖質量比為4∶1。

2.1.3 復合酶添加量對櫻桃酵素發酵的影響

由圖3可知，櫻桃酵素脂肪酶酶活隨復合酶的升高呈先上升后下降的趨勢；復合酶加酶量為500 U/g時脂肪酶酶活達到最高，為795 U/mL。還原力在復合酶添加量為200～300 U/g緩慢上升，300～400 U/g急速上升且400 U/g時含量最高，之后逐漸降低，復合酶添加量為400 U/g時還原力吸光度值為0.947，相當于1.84 mg/mL VC標準溶液。綜合參考脂肪酶酶活及還原力，選取復合酶添加量為400 U/g。

圖3 復合酶添加量對櫻桃酵素發酵的影響Fig.3 Effect of compound enzyme addition on cheery enzyme fermentation

2.1.4 接種量對櫻桃酵素發酵的影響

圖4 接種量對櫻桃酵素發酵的影響Fig.4 Effect of inoculum on cheery enzyme fermentation

由圖4可知，櫻桃酵素脂肪酶酶活隨接種量的增加呈先上升后下降的趨勢；接種量為10%時脂肪酶酶活達到最高，為807U/mL。還原力在接種量為5%～10%呈上升趨勢，之后呈下降趨勢，接種量為10%時還原力吸光度值為0.963，相當于1.87 mg/mL VC標準溶液。綜合參考脂肪酶酶活及還原力，選取接種量為10%。

2.1.5 發酵溫度對櫻桃酵素發酵的影響

圖5 發酵溫度對櫻桃酵素發酵的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on cheery enzyme fermentation

由圖5可知，櫻桃酵素脂肪酶酶活隨發酵溫度的升高呈先上升后下降的趨勢；發酵溫度30℃時脂肪酶酶活達到最高，為1 031 U/mL。還原力在發酵溫度為25～30℃迅速上升且30℃時水平達到最高，之后還原力下降，發酵溫度為30℃時還原力吸光度值為1.010，相當于1.96 mg/mL VC標準溶液，綜合參考脂肪酶酶活及還原力，選擇發酵溫度為30℃。

2.1.6 初始pH值對櫻桃酵素發酵的影響

由圖6可知，櫻桃酵素脂肪酶酶活隨發酵液初始pH值的升高呈先上升后下降的趨勢；初始pH值為4.8時脂肪酶酶活達到最高，為898 U/mL。還原力在發酵液初始pH值為3.8～4.4迅速上升，pH4.4～5.0下降，發酵液pH值為4.4時的還原力最高，吸光度值為0.966，相當于1.88 mg/mL VC標準溶液，故選擇初始pH為4.4。

2.2 正交試驗

試驗設有脂肪酶酶活和還原力2個指標，為了得到櫻桃酵素發酵最佳條件，采用多指標試驗簡易公式評分法。對試驗結果進行了分析，綜合評分計算公式：

式中：yi表示第i次試驗的綜合評分值，xij表示第j個指標的第i次試驗的測定值，Sj為樣本標準差，bj第j個指標的權重系數，其符號視測定值越大越好或越小越好而取正或負。j

本試驗2個指標同等重要，且脂肪酶活性（x1）、還原力（x2）都是越大越好，故權重系數分別為b1=l、b2=l，按以上公式計算綜合評分。

由表2可知，比較正交試驗中極差（R值）的大小，可以看出4個因素的對櫻桃酵素發酵的影響大小依次為A（發酵時間）＞D（接種量）＞C（復合酶添加量）＞B（加糖量）。櫻桃酵素發酵條件優化最優處理組合為A2B1C1D3，即發酵時間為4 d，加糖量（櫻桃果漿∶白砂糖質量比）為3∶1，復合酶添加量為300U/g、接種量為15%。在此條件下櫻桃酵素的脂肪酶酶活可達到1242U/mL，還原力吸光度值為0.680，相當于1.63mg/mLVC標準溶液，具有較強的抗氧化性[14-16]。

表2 櫻桃酵素發酵工藝優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for cheery enzyme fermentation process optimization

3 結論

水果酵素不僅保存了發酵原料中所固有的營養物質，有些有效成分的含量還能夠大幅度增加，同時也產生了一些新的生物活性成分和生物酶。試驗以櫻桃酵素的脂肪酶酶活和還原力為考察指標，通過單因素和正交試驗優化了櫻桃酵素的發酵條件。結果表明，櫻桃酵素最佳發酵條件為復合酶添加量300 U/g、接種量15%、加糖量（櫻桃果漿∶白砂糖質量比）3∶1、發酵時間4 d；在此條件下櫻桃酵素呈淺橙黃色、透明，帶有櫻桃香氣和淡淡的酒香。脂肪酶酶活可達到1242U/mL，還原力相當于1.63mg/mLVC標準溶液。