響應面法優化茯苓多糖發酵培養基

鄒成梅，王甜甜，何思艷，田珍燕，鄭永良，占劍峰，王蔚新，吳 鵬*

（黃岡師范學院 生命科學學院 經濟林木種質改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室 大別山特色資源開發湖北省協同創新中心，湖北 黃岡 438000）

茯苓（Poria cocos），是擬層孔菌科真菌茯苓的干燥菌核，常寄生在松樹根上，形如甘薯，球狀，外皮淡棕色或黑褐色，內部粉色或白色[1]。茯苓的藥用部位是茯苓菌核，茯苓多糖是茯苓的主要有效成分[2-3]。茯苓多糖分為水溶性多糖和堿溶性多糖，不溶于乙醇、丙酮和乙醚，其結構是50個β-（1→3）結合的葡萄糖單位，每個β-（1→5）結合的葡萄糖基支鏈與l～2個β-（1→6）結合的葡萄糖基間隔[6-7]。

經過多年的發展，茯苓已廣泛應用于醫藥及保健食品領域方面，茯苓多糖的消耗也日趨增大，茯苓多糖提取的工藝也在不斷優化[8-9]。茯苓的生產可分為固體培養與液體發酵，國內多采用固體培養茯苓，以此來提取多糖，但該法存在木材消耗大、產量不高、生產周期較長等諸多問題。而液體發酵能夠連續地大規模進行工業化生產，大大縮短生產時間[10]，液體發酵也可通過工藝控制，使微生物在最適宜的溫度、酸堿度、溶氧水平和碳氮比等條件下生長，使其新陳代謝旺盛，在短期內獲得大量預期的代謝產物。因此，國內外采用液體發酵來獲得茯苓多糖的方式，已成為現在工業化生產的新方向。廖彥[11]在6 L發酵罐中液態發酵培養，茯苓菌生物量、胞內外多糖含量均于第11天達到最大值，分別為3.44 g/L、17.25 mg/g、1.58 g/L；李羿等[12]探討了茯苓搖瓶補料和發酵罐補料培養的發酵工藝，在5 L發酵罐發酵中，茯苓多糖的產量達到0.23mg/mL。但目前茯苓多糖產量均無法達到工業化生產要求。

本研究采用PB試驗[13-16]和響應面法（response surface methodology，RSM）優化[17-19]茯苓產粗多糖的發酵培養基組分，以期提高茯苓粗多糖的產量。通過液態發酵生產茯苓粗多糖，在一定程度上節約成本，提高發酵效率，為體外研究多糖成分抗氧化活性提供基礎條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與試劑

茯苓（Poria cocos）：黃岡九資河。

葡萄糖、硝酸鈉、無水氯化鈣、維生素B1（vitamin B1，VB1）（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；酵母粉（生化試劑）：上海瑞永生物科技有限公司；蛋白胨、瓊脂粉（均為生化試劑）：生工生物工程（上海）股份有限公司；磷酸二氫鉀（分析純）：天津市天力化學試劑有限公司；硫酸鎂（分析純）：天津博迪化工股份有限公司。

1.1.2 培養基

普通固體培養基：葡萄糖40 g/L，蛋白胨7.5 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，瓊脂粉20 g/L，121℃條件下滅菌20 min。

種子液體培養基：葡萄糖40 g/L，蛋白胨7.5 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，121℃條件下滅菌20 min。

初始發酵培養基：葡萄糖40 g/L，酵母粉5 g/L，硫酸鎂1.67 g/L，蛋白胨30 g/L，硝酸鈉5 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，VB11 g/L，無水氯化鈣0.1 g/L，121℃條件下滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

AL204電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）股份有限公司；RE-52AA旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；LX-B50L型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器：合肥華泰醫療設備有限公司；RB-CJ-1ND型超凈工作臺：北京瑞邦興業科技有限公司；SPX-150生化培養箱：中儀國科（北京）科技有限公司；TG16-WST臺式高速離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司；FD系列冷凍干燥機：上海拓紛機械設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化、純化及培養條件

活化：采用無菌移液槍吸取2%的茯苓菌種于種子液體培養基內進行液體發酵，在26.5℃的恒溫培養箱中培養3d。

篩選及純化：將活化的菌種分梯度稀釋，用無菌移液槍吸取活化好的菌液1mL，放入9mL的無菌水中即為10-1稀釋液，如此重復，依次制成10-2～10-8的稀釋液，將10-5～10-84管稀釋液各取0.2 mL，接種于普通固體培養基中，26.5℃條件下培養，挑選好的單菌落通過劃線法再次得到純種，單個純種斜面培養3 d，挑取菌種于種子液培養基中培養3 d，測定菌株的茯苓粗多糖產量，挑選產量最高的菌種進行培養和后續試驗。

種子液：按2%接種量接種于種子液體培養基中，于26.5℃溫度下，液體發酵3 d，得種子液，并保種冷藏。

發酵培養：按2%的接種量，將種子液接種于50 mL的初始發酵培養基中，于26.5℃的恒溫培養箱中培養3 d。

1.3.2 茯苓粗多糖產量的測定

將培養3d后的50mL菌液在旋轉蒸發儀中濃縮至15mL，加入40 mL的體積分數95%的乙醇溶液醇沉，過濾后在沉淀中加入60 mL的蒸餾水，放入離心管中，經3 000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀中再加入20 mL蒸餾水，繼續離心10 min，棄上清，將沉淀置于培養皿中，真空干燥24 h，稱質量，得到茯苓粗多糖。

1.3.3 Plackett-Burman試驗設計

Plackett-Burman（PB）試驗設計是響應面試驗設計的一種，用于中心組合試驗之前挑選優化因素的一種試驗設計方法。參考文獻[20-22]，選擇影響茯苓粗多糖產量的8個因素葡萄糖（A）、酵母粉（B）、蛋白胨（C）、硝酸鈉（D）、磷酸二氫鉀（E）、硫酸鎂（F）、VB1（G）和無水氯化鈣（H），以茯苓粗多糖產量（Y）為響應值，選取N=12的PB試驗設計對影響茯苓粗多糖產量的8個因素的顯著性進行考察，將每個因素分為高（+1）、低（-1）2個水平，其中高水平是低水平的1.5倍。PB試驗設計因素與水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design

1.3.4 最陡爬坡試驗設計

在PB試驗的基礎上，根據各因素的效應值來選擇合適的步長，用來快速找出最佳區域，變化方向均由效應值的正負確定，正效應的因素應取低值依次增大，負效應的因素應取高值依次減小。經最陡爬坡試驗得到茯苓粗多糖產量的因素拐點，作為下一步響應面分析的中心點。

1.3.5 響應面分析試驗設計

根據最陡爬坡試驗的結果，得到Box-Behnken試驗的中心點，以相鄰的上下兩個實際步長為高低水平，以茯苓粗多糖產量（Y）為響應值，對茯苓粗多糖產量的影響因素葡萄糖（X1）、酵母粉（X2）、硫酸鎂（X3）進行響應面分析試驗，得到最優方案。響應面試驗設計因素與水平見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗結果

按PB試驗設計進行試驗，PB試驗設計與結果見表3，各因素主效應分析試驗結果見表4。

表3 Plackett-Burman試驗設計與結果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments

表4 Plackett-Burman試驗的效應分析Table 4 Effect analysis of Plackett-Burman experiments

由表4可知，8個因素中貢獻值最大的3個因素分別是葡萄糖、硫酸鎂和酵母粉，其可信度均在95%以上，對結果呈顯著影響（P＜0.05）。因此，選擇葡萄糖、硫酸鎂和酵母粉添加量作為主要影響因素進行下一步試驗。

2.2 最陡爬坡試驗設計及結果

經過PB試驗后，選擇3個主要效應因素葡萄糖（X1）、酵母粉（X2）、硫酸鎂（X3）進行最陡爬坡試驗，確定最佳水平范圍，最陡爬坡試驗設計及結果見表5。

由表5可知，當葡萄糖添加量為50 g/L、酵母粉添加量為20 g/L和硫酸鎂添加量為2.0 g/L時，茯苓粗多糖產量最高，因此選擇第4組試驗作為Box-Behnken試驗的中心點，進行Box-Behnken試驗。

表5 最陡爬坡試驗設計Table 5 Design of the steepest climbing experiments

2.3 響應面試驗優化

2.3.1 響應面試驗設計與結果

在PB試驗和最陡爬坡試驗基礎上，應用Design-Expert 8.0軟件，以茯苓粗多糖產量（Y）作為響應值，對葡萄糖（X1）、酵母粉（X2）和硫酸鎂（X3）添加量3個因素進行3因素3水平的Box-Behnken試驗，Box-Behnken試驗設計及結果見表6，回歸模型方差分析結果見表7。

表6 Box-Behnken試驗設計及結果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments

運用Design-Expert8.0軟件對各因素進行二次多項式回歸擬合后，得到茯苓粗多糖產量高低響應面回歸模擬方程：

由表7可知，該回歸模型的影響極顯著（P＜0.01），其中X1對響應值的影響顯著（P＜0.05），X1X2、X12、X22對響應值的影響極顯著（P＜0.01），其他項影響均不顯著（P＞0.05）。失擬項P值為0.568 7＞0.05，不顯著，表明模型符合實際情況，可以用此模型對茯苓粗多糖的產量進行分析和預測。

表7 回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

2.3.2 響應面分析及驗證

應用Design-Expert 8.0軟件獲得葡萄糖、酵母粉、硫酸鎂添加量3個因素交互作用對茯苓粗多糖產量影響的響應面和等高線，結果見圖1。由圖1可知，葡萄糖與酵母粉交互作用等高線中心區域呈橢圓形，表明兩因素存在明顯的交互作用。所有響應面圖形坡面陡峭，方程的拋物線圖形開口全部向下，即最大值存在，響應面覆蓋最大值所在區域。

根據回歸模擬方程可以算出茯苓粗多糖產量的最大預測值為142.5 mg/100 mL，此時培養基的主要成分及添加量為：葡萄糖47.12 g/L、酵母粉20.53 g/L、硫酸鎂1.81 g/L、蛋白胨30 g/L、硝酸鈉5 g/L、磷酸二氫鉀1.0 g/L、VB11 g/L、無水氯化鈣0.1g/L。為方便實際操作，修改培養基成分為葡萄糖47.1g/L、酵母粉20.5g/L、硫酸鎂1.8 g/L、蛋白胨30 g/L、硝酸鈉5 g/L、磷酸二氫鉀1.0 g/L、VB11 g/L、無水氯化鈣0.1g/L。按此培養基成分進行試驗，得到茯苓粗多糖的產量為138 mg/100 mL，與模型預測值相接近，較初始發酵培養基，茯苓粗多糖是優化前的1.3倍。

圖1 葡萄糖、酵母粉和硫酸鎂添加量交互作用對茯苓粗多糖產量影響的響應面及等高線Fig.1 Response surface plots and contour line of the effects of interaction between glucose,yeast powder and magnesium sulfate addition on the yield of crude polysaccharide fromPoria cocos

3 結論

根據PB試驗結果從8個因素中選擇了具有重要效應的3個因素葡萄糖、酵母粉和硫酸鎂作為主要影響因素。經過Box-Behnken試驗設計及響應面分析，對培養基的組分優化，確定了最優培養基成分為：葡萄糖47.1 g/L、酵母粉20.5 g/L、硫酸鎂1.8 g/L、蛋白胨30 g/L、硝酸鈉5 g/L、磷酸二氫鉀1.0 g/L、VB11 g/L、無水氯化鈣0.1 g/L。在此最優發酵培養基條件下，茯苓粗多糖產量為138 mg/100 mL，是優化前（102 mg/100 mL）的1.3倍。