白藜蘆醇丹陽(yáng)黃酒抗氧化活性和穩(wěn)定性研究

喬曉月，靳迎春，曹喜濤，2*，徐志堅(jiān)，屠 潔，2，劉冠卉，4，張兆俊，季更生，2，張國(guó)政，2

（1.江蘇科技大學(xué) 生物技術(shù)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212018；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶業(yè)研究所 農(nóng)業(yè)部蠶桑遺傳改良重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，江蘇 鎮(zhèn)江 212018；3.江蘇省丹陽(yáng)市金丹陽(yáng)酒業(yè)有限公司，江蘇 鎮(zhèn)江 212300；4.江蘇科技大學(xué)糧食學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212004）

黃酒是我國(guó)特有的具有中華民族特色的最為古老的酒類之一，被譽(yù)為“國(guó)酒”，它與葡萄酒、啤酒并稱為世界三大古酒。在我國(guó)，黃酒是一種集烹飪、營(yíng)養(yǎng)、飲用和保健作用的傳統(tǒng)民族酒[1]。江蘇丹陽(yáng)黃酒釀造歷史源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，憑文獻(xiàn)記錄的已有1 700年，俗名陳酒，早在1971年被江蘇省評(píng)酒會(huì)評(píng)為江蘇省“七大名酒”之一。丹陽(yáng)黃酒獨(dú)樹一幟，其酒色澤黃橙透明，鮮甜香美，醇和爽口，灌壇封缸貯窖越經(jīng)久，風(fēng)味越佳，是比較理想的酒精飲料[2]。

白藜蘆醇（resveratrol，Res），化學(xué)名為3,5,4'-三羥基芪（3,5,4'-trihydroxystilbene），作為含有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酚化合物，白藜蘆醇是植物在逆境刺激非脅迫條件下產(chǎn)生的植物次生代謝產(chǎn)物，具有較強(qiáng)的抗菌作用，是植物保護(hù)素或植物抗毒素[3]。此外，白藜蘆醇可以清除自由基，抑制由活性氧引起的脂質(zhì)過(guò)氧化和脂蛋白修飾，從而起到抗氧化、保護(hù)心血管的作用[5-6]。總之，白藜蘆醇具有抗菌、抗氧化、抗癌、延緩衰老、心血管保護(hù)等諸多生理作用，在藥品、保健食品、化妝品方面有著良好的應(yīng)用前景[3]。目前，國(guó)內(nèi)僅有余國(guó)軍等[4]發(fā)明了一種在半甜型湖北房縣黃酒中添加白藜蘆醇的方法，但未見(jiàn)該專利研究含白藜蘆醇房縣黃酒的穩(wěn)定性。而在丹陽(yáng)黃酒——甜型黃酒為代表的白藜蘆醇黃酒研究未見(jiàn)報(bào)道。

本研究通過(guò)向丹陽(yáng)黃酒中添加白藜蘆醇，探討了添加白藜蘆醇的丹陽(yáng)黃酒體外抗氧化活性和穩(wěn)定性，旨在為深入開發(fā)具有更好保健作用的新型丹陽(yáng)黃酒做前期研究，但白藜蘆醇在黃酒中的穩(wěn)定性還需要進(jìn)一步的研究來(lái)提高。添加白藜蘆醇丹陽(yáng)黃酒的開發(fā)可以迎合消費(fèi)者新穎、健康的消費(fèi)理念，為古老的丹陽(yáng)黃酒注入現(xiàn)代科技元素，提高產(chǎn)品知名度和消費(fèi)量，為黃酒行業(yè)的創(chuàng)新發(fā)展貢獻(xiàn)力量[7]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃酒（江蘇丹陽(yáng)市金丹陽(yáng)酒業(yè)有限公司五年陳釀老陳酒）：購(gòu)自鎮(zhèn)江當(dāng)?shù)爻校?/p>

反式白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.8%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、二苯代苦味酰基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、無(wú)水乙醇、水楊酸、硫酸亞鐵、30%過(guò)氧化氫、三氯乙酸、三氯化鐵、鐵氰化鉀、2,2-聯(lián)氨-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二胺鹽（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate，ABTS）、過(guò)硫酸鉀（均為分析純）：上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Spectra Max i3酶標(biāo)儀：美國(guó)Molecular Devices公司；1260型高效液相色譜（high performance liquid chromatog raphy，HPLC）儀：安捷倫科技有限公司；RE-52B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：南京科爾儀器有限公司；循環(huán)水式多用真空泵SHZ-D（Ⅲ）：常州英峪予華儀器有限公司

1.3 方法

1.3.1 白藜蘆醇丹陽(yáng)黃酒的制備方法

準(zhǔn)確稱量25.000 mg的白藜蘆醇樣品，用無(wú)水乙醇溶解且定容在25 mL的容量瓶，獲得1.00 mg/mL的樣品原液，并用丹陽(yáng)黃酒稀釋，獲得質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL的白藜蘆醇丹陽(yáng)黃酒。分別取0.10 mg/mL的添加白藜蘆醇的丹陽(yáng)黃酒0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL，再用蒸餾水補(bǔ)足至1 mL作為稀釋液，同樣的方法稀釋普通黃酒、0.10 mg/mL的維生素C（vitamin C，VC）溶液和1.00mg/mL的維生素C溶液。0.10 mg/mL維生素C溶液編號(hào)A，1.00 mg/mL的維生素C溶液編號(hào)B，白藜蘆醇丹陽(yáng)黃酒編號(hào)C，普通丹陽(yáng)黃酒編號(hào)D。

1.3.2 DPPH自由基清除能力測(cè)定[8-10]

取2 mL樣品分別加入2 mL 0.4 mmoL/L的DPPH無(wú)水乙醇溶液，使其混合均勻，室溫下避光靜置30 min，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定其吸光度值為Ai。同樣，將添加白藜蘆醇的黃酒樣品換成等體積的無(wú)水乙醇，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定其吸光度值為Ao。再將DPPH溶液換成等體積的無(wú)水乙醇，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定其吸光度值為Aj，所有樣品重復(fù)測(cè)定3次，以0.10 mg/mL維生素C溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，計(jì)算半抑制濃度（half maximal inhibitoryconcentration，IC50）值。DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下：

1.3.3 羥自由基清除能力測(cè)定[10-11]

采用水楊酸法測(cè)定樣品羥自由基清除能力。分別配制 8.8 mmol/L H2O2、9.0 mmol/L硫酸亞鐵溶液、9.0 mmol/L水楊酸（無(wú)水乙醇配），體積都為1 mL。取樣品1 mL，分別加1 mL硫酸亞鐵溶液、1 mL水楊酸溶液、1 mL樣品，最后加過(guò)氧化氫啟動(dòng)反應(yīng)，37℃條件下反應(yīng)15 min后，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)x；將樣品換成去離子水測(cè)定吸光度值A(chǔ)o；最后以硫酸亞鐵、水楊酸、樣品和去離子水混合液測(cè)定吸光度值A(chǔ)xo，所有樣品重復(fù)測(cè)定3次，以1.00 mg/mL維生素C溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。計(jì)算IC50值。羥自由基清除率計(jì)算公式如下：

1.3.4 ABTS自由基清除能力測(cè)定[12-14]

取去離子水配制7mmol/LABTS溶液，同樣配制2.6mmol/L的過(guò)硫酸鉀水溶液取88 μL和ABTS預(yù)備液5 mL混合均勻于室溫下避光放置16 h形成ABTS工作液，將ABTS工作液用無(wú)水乙醇適當(dāng)稀釋，使其在波長(zhǎng)734 nm處的吸光度值在0.7左右。將0.2 mL樣品與1.9 mL的ABTS溶液混合均勻，靜置3min后測(cè)定其吸光度值A(chǔ)s。以蒸餾水代替樣品測(cè)定吸光值A(chǔ)o，所有樣品重復(fù)3次。以0.10 mg/mL維生素C溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，計(jì)算IC50值。ABTS自由基清除率計(jì)算公式如下：

1.3.5 總抗氧化能力測(cè)定[10，15-17]

取1 mL樣品，加入0.2 mol/L pH 6.6的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）1 mL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鐵氰化鉀1 mL混合均勻，在50℃條件下水浴20 min，取出后快速冷卻加入10%三氯乙酸1 mL，離心（4 000 r/min、5 min）取上清液2mL，加入2mL的蒸餾水及0.4mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%三氯化鐵混合均勻，放置10 min，在波長(zhǎng)700 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)。所有樣品重復(fù)測(cè)定3次。以0.10 mg/mL維生素C溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。吸光度值越大，說(shuō)明樣品還原力越強(qiáng)。

1.3.6 添加白藜蘆醇的新型丹陽(yáng)黃酒穩(wěn)定性研究

取1mg/mL的白藜蘆醇樣品原液，用丹陽(yáng)黃酒分別稀釋成質(zhì)量濃度為10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL和100 μg/mL的添加白藜蘆醇的丹陽(yáng)黃酒。室內(nèi)未避光常溫（22～27℃）密封放置60 d，分別于0、3 d、6 d、12 d、24 d、36 d、48 d、60 d測(cè)定新型丹陽(yáng)黃酒中的白藜蘆醇含量，研究其在常溫下的穩(wěn)定性。

1.3.7 黃酒中白藜蘆醇含量的測(cè)定

采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定新型丹陽(yáng)黃酒中的白藜蘆醇含量[18]。

樣品預(yù)處理：取10 mL葡萄酒，加10 mL乙酸乙酯，搖動(dòng)萃取15 min，靜置分層后分液，再加入10 mL乙酸乙酯重復(fù)一次，將兩次有機(jī)相合并后40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，殘留物用甲醇溶解定容至5 mL。高效液相色譜儀分析測(cè)定前經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾。操作過(guò)程中注意避光。

HPLC色譜條件：色譜柱C18柱（4.6mm×150mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈和0.1%醋酸水（35∶65，V/V），流速1.5 mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)306 nm，進(jìn)樣量20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)DPPH自由基清除率

將0.10 mg/mL白藜蘆醇丹陽(yáng)黃酒、0.10 mg/mL維生素C溶液和不含白藜蘆醇的普通丹陽(yáng)黃酒分別進(jìn)行梯度稀釋，比較3種樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，在0～0.8 mL/mL范圍內(nèi)DPPH自由基清除率與不同黃酒和維生素C溶液之間呈良好的線性關(guān)系；超過(guò)0.8 mL/mL之后清除率趨向平穩(wěn)，添加白藜蘆醇后的丹陽(yáng)黃酒對(duì)DPPH自由基清除能力在不同濃度時(shí)的清除率均明顯高于普通丹陽(yáng)黃酒清除率，兩值相差15%以上，說(shuō)明新型丹陽(yáng)黃酒對(duì)DPPH的清除能力大于普通黃酒。

圖1 不同的丹陽(yáng)黃酒及VC對(duì)DPPH自由基清除能力Fig.1 Scavenging capacities of different DanyangHuangjiuand VC on DPPH free radical

表1 三種樣品的DPPH自由基清除率IC50值Table 1 IC50values of three samples on scavenging DPPH free radical

3種樣品DPPH自由基清除IC50值見(jiàn)表1。由表1可知，IC50值從小到大排列為維生素C（0.35 mL/mL）＜白藜蘆醇丹陽(yáng)黃酒（0.40 mL/mL）＜普通丹陽(yáng)黃酒（0.70 mL/mL），說(shuō)明對(duì)于DPPH自由基清除能力，維生素C溶液＞白藜蘆醇丹陽(yáng)黃酒＞普通丹陽(yáng)黃酒，表明白藜蘆醇清除能力明顯強(qiáng)于普通丹陽(yáng)黃酒。

2.2 對(duì)羥自由基清除率

將0.10 mg/mL白藜蘆醇丹陽(yáng)黃酒、1.00 mg/mL維生素C溶液和不含白藜蘆醇的丹陽(yáng)黃酒分別進(jìn)行梯度稀釋，比較3種樣品對(duì)羥自由基的清除能力，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，在0～1.00 mL/mL范圍內(nèi)羥自由基清除率呈良好的線性關(guān)系；添加白藜蘆醇后的丹陽(yáng)黃酒羥自由基清除率在不同濃度時(shí)比普通丹陽(yáng)黃酒略高，兩者清除率差值不超過(guò)10%，說(shuō)明新型丹陽(yáng)黃酒的羥自由基清除能力略高于普通丹陽(yáng)黃酒。

圖2 不同的丹陽(yáng)黃酒及VC對(duì)羥自由基清除能力Fig.2 Scavenging capacities of different DanyangHuangjiuand VC on hydroxyl free radical

3種樣品羥自由基清除IC50值見(jiàn)表2。由表2可知，IC50值從小到大排列為維生素C（0.50 mL/mL）＜白藜蘆醇丹陽(yáng)黃酒（0.80 mL/mL）＜普通丹陽(yáng)黃酒（0.81 mL/mL），說(shuō)明對(duì)于羥自由基，維生素C溶液清除能力比白藜蘆醇丹陽(yáng)黃酒強(qiáng)，白藜蘆醇丹陽(yáng)黃酒清除能力比普通丹陽(yáng)黃酒略強(qiáng)。

表2 三種樣品的羥自由基清除率IC50值Table 2 IC50values of three samples for scavenging·OH

2.3 對(duì)ABTS自由基清除率

將0.10 mg/mL白藜蘆醇丹陽(yáng)黃酒、0.10 mg/mL維生素C溶液和不含白藜蘆醇的丹陽(yáng)黃酒分別進(jìn)行梯度稀釋，比較3種樣品對(duì)ABTS自由基的清除能力，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，在0～1.00 mL/mL范圍內(nèi)ABTS自由基清除率與不同黃酒和維生素C溶液溶液之間呈良好的線性關(guān)系。在0.20～1.00 mL/mL添加白藜蘆醇后的丹陽(yáng)黃酒對(duì)ABTS自由基清除率明顯比普通黃酒高，兩值相差10%以上，說(shuō)明白藜蘆醇丹陽(yáng)黃酒對(duì)ABTS自由基的清除能力大于普通丹陽(yáng)黃酒。

圖3 不同的丹陽(yáng)黃酒及VC對(duì)ABTS自由基清除能力Fig.3 Scavenging capacities of different DanyangHuangjiuand VC on ABTS free radical

3種樣品ABTS自由基清除IC50值見(jiàn)表3。由表3可知，IC50值從小到大排列為白藜蘆醇丹陽(yáng)黃酒（0.51 mL/mL）＜維生素C（0.65 mL/mL）＜普通丹陽(yáng)黃酒（0.80 mL/mL），說(shuō)明對(duì)于ABTS自由基，白藜蘆醇丹陽(yáng)黃酒清除能力比維生素C溶液和普通丹陽(yáng)黃酒都強(qiáng)。

表3 三種樣品的DPPH自由基清除率IC50值Table 3 IC50values of three samples for scavenging DPPH

2.4 總抗氧化能力

將0.10mg/mL白藜蘆醇丹陽(yáng)黃酒、0.10mg/mL維生素C溶液和不含白藜蘆醇的丹陽(yáng)黃酒分別進(jìn)行梯度稀釋，比較3種樣品對(duì)鐵氰化鉀的還原力，即總抗氧化能力，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 不同的丹陽(yáng)黃酒及VC總抗氧化能力比較Fig.4 Comparison of total antioxidant activities of different DanyangHuangjiuand VC

由圖4可知，三種樣品的鐵氰化鉀還原力均呈線性增長(zhǎng)趨勢(shì)。相同酒樣添加量下，新型丹陽(yáng)黃酒的還原力明顯高于普通黃酒，且酒樣添加量越大，新型黃酒與普通丹陽(yáng)黃酒的吸光度值相差越大，但維生素C的吸光度值始終高于兩種丹陽(yáng)黃酒，說(shuō)明在總抗氧化能力上，維生素C的溶液的抗氧化能力高于兩種黃酒，白藜蘆醇丹陽(yáng)黃酒高于普通丹陽(yáng)黃酒。

2.5 新型丹陽(yáng)黃酒穩(wěn)定性

添加白藜蘆醇質(zhì)量濃度分別為10 μg/mL、20 μg/mL、50μg/mL和100μg/mL的丹陽(yáng)黃酒，室內(nèi)未避光常溫密封放置60 d，分別于0、3 d、6 d、12 d、24 d、36 d、48 d、60 d用HPLC測(cè)定新型丹陽(yáng)黃酒中的白藜蘆醇含量，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，新型黃酒中的白藜蘆醇含量在前3 d降解快速，3～60 d降解速度減小趨于平緩，初始質(zhì)量濃度分別為100 μg/mL、50 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL的白藜蘆醇丹陽(yáng)黃酒在60 d時(shí)白藜蘆醇的濃度分別下降到23.12 μg/mL、9.34 μg/mL、3.40 μg/mL、1.43 μg/mL。說(shuō)明白藜蘆醇在黃酒中的穩(wěn)定性不佳，可能會(huì)影響到白藜蘆醇黃酒的抗氧化活性。因此，新型丹陽(yáng)黃酒的開發(fā)也會(huì)進(jìn)一步深入研究如何提高白藜蘆醇穩(wěn)定性，來(lái)保證新型黃酒產(chǎn)品的功能。

圖5 不同濃度的新型丹陽(yáng)黃酒中的白藜蘆醇濃度變化Fig.5 Changes of resveratrol concentration in new types of Danyang Huangjiuwith different resveratrol concentrations

3 結(jié)論

結(jié)果表明，加入白藜蘆醇后的丹陽(yáng)黃酒比普通的丹陽(yáng)黃酒總抗氧化能力強(qiáng)，而且高于相同濃度的維生素C溶液，在DPPH自由基清除能力上，新型黃酒也高于普通黃酒，在羥自由基和ABTS自由基清除能力上，只有當(dāng)酒樣添加量＞0.2mL/mL時(shí)，新型黃酒高于普通黃酒。以上結(jié)果說(shuō)明，質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL的白藜蘆醇丹陽(yáng)黃酒的抗氧化能力比普通丹陽(yáng)黃酒有了明顯的提高。但新型丹陽(yáng)黃酒中白藜蘆醇穩(wěn)定性較差，因此，需要進(jìn)一步研究如何降低環(huán)境對(duì)丹陽(yáng)黃酒中白藜蘆醇的影響，提高白藜蘆醇在黃酒中的穩(wěn)定性。