基于途徑分析的產甘油有孢漢遜酵母菌株的選育

趙貝貝，劉慧燕，方海田*，馬若霜，王 茹，李金娜

（1.寧夏食品微生物應用技術與安全控制重點實驗室，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學 農學院，寧夏 銀川 750021）

甘油是葡萄酒發酵過程中最主要的副產物之一，在葡萄酒發酵初期產生，其含量僅次于二氧化碳和乙醇。較高含量的甘油可賦予葡萄酒甘甜、圓潤和柔滑等特性，且甘油的無色無味特性對葡萄酒的香氣影響不大，但其甜味和粘性特性，在含量增加時可以改善葡萄酒的甜味、酒體與豐滿度。同時，甘油能夠平衡酒中的酸感，增加口感的復雜性，有利于改善葡萄酒的感官質量[1]。研究表明，高濃度的甘油會抑制葡萄酒的灼熱、粗糙和苦味等不良味感[2]。近年來，國內外對高產甘油酵母的研究日益增多，著重于提高葡萄酒中酵母發酵生產甘油的能力。通過選育高產甘油發酵菌種是提高葡萄酒中甘油濃度的重要途徑，也是改善干、半干型葡萄酒質量的重要措施[3]。在葡萄酒發酵過程中，提高甘油的產量會使碳代謝向甘油合成的方向轉移，從而降低乙醇和副產物的代謝分流量和產量，提高葡萄酒的口感[4]，此外甘油的非揮發性也會保留葡萄酒的香氣物質[5]，對葡萄酒的品質產生積極的影響。非釀酒酵母（non-Saccharomycesyeasts）可以增加葡萄酒感官質量特征的復雜性[6]，其中有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）起到非常重要的作用，具有良好的甘油合成能力，且具有產香氣物質乙酸酯[7-9]、低產高級醇[8]、高產酯類[10]和產糖苷酶的能力[11]。諸多學者研究，發現大多數葡萄汁有孢漢遜酵母適合與釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）進行混菌發酵，具有良好的葡萄酒釀造環境適應性和增香釀造潛力[12-15]。

試驗前期以寧夏賀蘭山東麓葡萄產區分離得到的葡萄汁有孢漢遜酵母GF-23為出發菌株，通過分析甘油的合成途徑和育種策略，篩選高效表達3-磷酸甘油脫氫酶（glycerol-3-phosphate dehydrogenase，GPD）和3-磷酸甘油酯酶（glycerol-3-phosphatase，GPP）的突變菌株，并且通過高滲透壓環境誘導合成甘油，以提高胞內滲透壓?；谶@種機理，本試驗以葡萄汁有孢漢遜酵母GF-23為出發菌株，采用誘變和氯化鈉高滲濃度改變細胞滲透壓，促使GPD和GPP酶高效表達，從而增加甘油產量。期望能有效解決葡萄酒發酵過程中殘糖過高的問題，同時提高甘油濃度、適度降低乙醇的含量，以提升葡萄酒品質，旨在為賀蘭山東麓葡萄酒產區提供優良本土發酵菌株及有效解決葡萄酒發酵過程中殘糖過高的問題提供思路和途徑，推進本土葡萄酒發酵菌株的研究和應用水平，提高葡萄酒品質。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）GF-23：本實驗室保存菌種；葡萄糖、氯化鈉（均為國產分析純）、酵母膏、蛋白胨（均為生化試劑）：國藥集團化學試劑有限公司；Megazyme甘油檢測試劑盒：北京普利萊基因技術有限公司。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養基：蛋白胨20 g、酵母膏10 g、葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH，115℃高壓蒸汽滅菌30 min。

YPD固體培養基：YPD液體培養基中加入2%瓊脂，115℃高壓蒸汽滅菌30 min。

NaCl高滲培養基：蛋白胨20g、酵母膏10g、葡萄糖20g，蒸餾水1 000 mL，加入不同質量濃度的NaCl。NaCl的質量濃度分別設置為：0、50 g/L、75 g/L、100 g/L、125 g/L[16]。

1.2 儀器與設備

BA310LED Digital生 物數碼顯微鏡：麥克奧迪實業集團有限公司；TGL-16M高速臺式冷凍離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；UV-Ⅷ紫外誘變儀：北京賽百奧科技有限公司；752型分光光度計：上海精科實業有限公司；YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博迅實業有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄汁有孢漢遜酵母甘油生物合成途徑分析

在酵母細胞中甘油的合成是由糖酵解途徑的中間代謝產物磷酸二羥丙酮（dihydroxyacetone phosphate，DHAP）開始，在酶的作用下首先被還原為3-磷酸甘油（glycerol-3-phosphate，G3P），再在3-磷酸甘油酯酶（GPP）作用下脫去磷酸基而生成甘油。在耐高滲透壓酵母中，甘油合成相當復雜，受高滲甘油應答途徑（high osmolarityglycerol，HOG）和通道蛋白（channel protein，CP）Fps1p的控制外，還受其他因素的影響[17]。

1.3.2 菌株生長曲線的測定

從冰箱取出出發菌株GF-23，接種到新鮮的斜面培養基，用接種環挑取斜面菌種一環，涂布于YPD固體培養基平板培養，挑取長勢較好的單菌落鑒定，接種于裝有5 mL的YPD液體培養基，28℃靜置培養14 h，得到菌株GF-23種子液。將種子液以5%的接種量轉入新鮮的液體培養基三角瓶，28℃靜置培養。每隔2 h，取菌液測定吸光度值，以未接種的液體培養基作為空白對照，繪制菌株GF-23的生長曲線[18]。

1.3.3 菌懸液的制備

收集對數期的菌液，6 000 r/min、4℃離心，棄上清，用生理鹽水洗滌3次，經適當稀釋，制成106～108CFU/mL的菌懸液[19]。

1.3.4 紫外線誘變

吸取5 mL的菌懸液于10個滅過菌的培養皿中，依次將培養皿按照時間順序（30 s、40 s、50 s、60 s、70 s、80 s、90 s、120 s、150 s、180 s）分別置于波長為254 nm、距離30 cm的紫外燈下進行照射。照射結束后，取0.2 mL涂板。均勻涂布于YPD固體培養基上，避光，28℃培養48～72 h。對平板上的菌落進行計數并計算致死率，以未經紫外線照射的菌落為空白對照[20]。致死率的計算公式如下[21]：

式中：A為未經處理的平板菌落數，CFU/mL；B為與A平行經誘變處理后的再生菌落數，CFU/mL。

1.3.5 菌株的篩選

（1）初篩

為提高菌株生存能力，挑取致死率在85%左右的單菌落，確定紫外誘變的時間，將培養好的上清液稀釋至適當倍數，用Megazyme甘油檢測試劑盒測定甘油的產量，選取甘油產量較高的菌株為初篩入選菌株（每個菌株3個平行）。

（2）復篩

對初篩得到的甘油產量較高的菌株，每株3個平行，甘油產量較高的菌株為復篩入選菌株進行后續試驗。篩選出的菌株再進行重復誘變，涂布于50 g/L的NaCl高滲培養基，依次重復誘變步驟，逐漸增加NaCl的質量濃度75 g/L、100 g/L、125 g/L，綜合考慮菌株的生長周期和產甘油能力等因素，確定菌株的耐高滲NaCl質量濃度。

1.3.6 高產甘油菌株的遺傳穩定性研究

將最后篩選得到的菌株接種于固體培養基傳代，連續傳5代。每傳代一次都在相同培養條件下進行發酵，測量發酵液中的甘油含量，分析傳代次數對菌株生產性能的影響，確定突變菌株產甘油性能是否穩定[22]。

1.3.7 葡萄酒發酵試驗

（1）耐受性試驗[23-25]

分別對菌株進行耐SO2、耐酒精能力的測試。選擇產甘油能力較高，穩定遺傳的菌株，按5%接種量接種于葡萄汁中發酵，同時添加亞硫酸和調整葡萄糖的質量濃度分別為200mg/L、250g/L。28℃發酵6d，測其發酵性能的穩定性，并與親株作發酵性能比較。每個酵母菌株做3個平行試驗，與未經誘變的原始菌株作對照。

（2）發酵速率的測定

采用CO2失重法[24]測定發酵速率。

1.3.8 分析檢測

總糖的測定采用斐林試劑法[24]；甘油含量的測定采用Megazyme甘油檢測試劑盒[26]；乙醇含量的測定參考國標GB 5009.225—2016《酒中乙醇濃度的測定》[24]。

2 結果與分析

2.1 葡萄汁有孢漢遜酵母甘油生物合成途徑分析

2.1.1 甘油的生物合成途徑及關鍵節點分析

在葡萄酒發酵過程中，甘油的主要功能是維持酵母細胞內煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）（氧化態）/NADH（還原態）的平衡，并且對酒精發酵的啟動具有重要作用。另外，甘油可參與體內能量代謝或合成糖原和脂肪，甘油還可作為發酵過程中濃度較高的糖、酒精、SO2產生的滲透壓力的代謝調節物質。

甘油在酵母的細胞質中合成，其合成速率是由3-磷酸甘油脫氫酶（GPD）的酶促反應所控制，3-磷酸甘油脫氫酶（GPD）的合成及酶活性大小會直接影響到整個代謝過程中甘油的合成（見圖1）[1，27]。在酵母細胞質中，由糖分解產生的磷酸二羥基丙酮被3-磷酸甘油脫氫酶（GPD）和3-磷酸甘油酯酶（GPP）催化后合成，每一種酶都有2種同工酶，GPP1p和GPP2p由滲透作用誘導合成。大量研究報道了3-磷酸甘油途徑是合成甘油的主要途徑，依賴NAD的甘油-3-磷酸脫氫酶GPD1p、GPD2p是酵母生成甘油的關鍵酶。3-磷酸甘油和磷酸二羥基丙酮也是合成甘油以外其他物質的重要媒介。3-磷酸甘油和磷酸二羥丙酮是合成磷脂的主要前體，磷酸二羥丙酮還是合成氨基酸的前體。

圖1 甘油的生物合成途徑Fig.1 Biosynthesis pathways of glycerol

當酵母細胞生長環境改變時，磷酸二羥丙酮的含量增加進而向3-磷酸甘油合成的方向轉化，誘導Gpd1/Gpd2基因高效表達，不斷合成甘油來抵御環境變化的影響，導致生成3-磷酸甘油醛含量極少，合成乙醇的代謝流減弱。陳獻忠等[28-29]的研究也證明，CgGPD基因的表達能夠顯著提高細胞耐滲透壓能力和甘油合成能力。甘油合成的最后反應是由3-磷酸甘油酯酶（GPP）脫磷酸完成的。GPD和GPP的高效表達使甘油的合成量增加。另外，在紫外線和高滲氯化鈉處理時，GPD與GPP以及兩個同工酶GPD1p、GPD2p和GPP1p、GPP2p誘導表達，使Gut1p基因表達受到抑制，因此促使葡萄糖轉向甘油的代謝流，甘油含量增加。有研究表明，在高滲透壓脅迫下誘導表達基因Gpd1和基因Gpp2，能迅速促使葡萄糖代謝流轉向甘油合成途徑，在胞內大量積累甘油以保護細胞。

2.1.2 高產甘油酵母突變菌株的育種策略

針對酵母菌中與甘油合成密切相關的三條途徑，可通過以下策略來選育高產甘油酵母突變菌株：（1）減弱甘油分解途徑。本途徑主要是將甘油分解為磷酸二羥丙酮，其中包含由GCY1或YPR1基因編碼的甘油脫氫酶和DAK1或DAK2基因編碼的二羥丙酮激酶，可通過營養缺陷或定向進化降低這些酶的活性。（2）增強甘油合成途徑?？商岣哧P鍵酶基因是編碼NAD+依賴型3-磷酸甘油脫氫酶的GPD2與POS5基因編碼的NADH激酶的合成劑量，增加甘油合成代謝流量。（3）將甘油合成途徑、甘油分解途徑和輔酶代謝途徑的改造同時應用在酵母中，最終獲得重組雜合菌，其提高甘油得率。（4）增強甘油通道蛋白基因FPS1，提高甘油得率。（5）利用產甘油酵母菌株的滲透壓耐受能力篩選突變菌株。（6）通過調控葡萄酒發酵條件，如通風、SO2、發酵溫度、發酵時間、pH、酒精濃度等都會影響到甘油的合成；含糖量高的葡萄也有利于甘油含量提高。

2.2 高產甘油葡萄汁有孢漢遜酵母突變菌株的誘變選育

2.2.1 菌株生長曲線的測定

出發菌株GF-23的生長曲線見圖2。由圖2可知，菌株在YPD培養基中生長迅速，6 h后進入對數生長期，16 h后進入穩定期，當菌體處于對數中后期時生長迅速，代謝旺盛，因此，選擇6～8 h菌體進行誘變試驗。

圖2 出發菌株GF-23的生長曲線Fig.2 Growth curve of original strain GF-23

2.2.2 紫外誘變最佳時間的確定

由圖3可知，紫外線對酵母GF-23的殺傷力比較強，在0～80 s時致死率隨誘變時間延長而提高，70 s時致死率達到85%，作用120 s時可以殺死99%的菌體。由于誘變產生的正負突變是隨機的，為提高菌株的生存能力，選擇能使致死率達到85%左右的70 s為最佳誘變時間。

圖3 葡萄汁有孢漢遜酵母GF-23的致死率曲線Fig.3 Lethality curve ofHanseniaspora uvarumGF-23

2.3 耐高滲葡萄汁有孢漢遜酵母突變菌株的篩選

酵母GF-23經過70 s的紫外誘變，測定各菌株的甘油產量，把其中甘油產量最高的一株菌株GY-1作為紫外誘變得到的最終菌株，將其涂布于高滲培養基，依次增加NaCl的質量濃度進行耐高滲酵母菌株篩選，出發及誘變菌株的生長形態結果見圖4。

圖4 出發菌株GF-23和突變菌株GY-1的菌落形態Fig.4 Colony morphologies of original strain GF-23 and mutant strain GY-1

由圖4可知，當NaCl質量濃度為50g/L時菌株GY-1生長較快，且形態較好；當NaCl質量濃度為75g/L時菌株GY-1生長較慢，但同菌株GF-23形態基本一致；當NaCl質量濃度為100 g/L、125 g/L時沒有菌落長出，原因可能是經過多次誘變嚴重影響了酵母菌的生長，使酵母菌在高濃度的滲透壓下不能生存?？紤]到菌株的生長周期對葡萄酒的影響，選擇菌株GY-1耐受NaCl質量濃度為50 g/L。

2.4 耐高滲葡萄汁有孢漢遜酵母突變株GY-1的高產甘油能力分析

突變菌株GY-1用YPD液體培養基發酵培養，在發酵條件28℃，比較突變菌株GY-1與原始菌株GF-23甘油產量的變化，每隔2h測菌液的OD600nm值，并測定發酵48 h的產甘油含量，結果如圖5和圖6所示。

圖5 出發菌株GF-23和突變菌株GY1的生長狀態Fig.5 Growth status of original strain GF-23 and mutant strain GY1

圖6 出發菌株GF-23突變菌株GY-1發酵48 h的甘油產量Fig.6 Glycerol yield of mutant strain GY-1 and mutant strain GY1 after fermentation for 48 h

由圖5可知，突變株GY-1生長速度略低于原始菌株，大約在16h后進入穩定期，在相同培養條件下菌株GY-1的生物量少于菌株GF-23，說明菌株GY-1可以充分的利用發酵液中營養物質，有助于發酵液中代謝產物的積累。由圖6可知，在三角瓶中發酵培養48 h后，甘油產量為0.44%，是原始菌株的3.33倍。

2.5 突變菌株的生長特性與遺傳穩定性分析結果

為了檢測所得到的誘變菌株GY-1是否具有穩定的遺傳性狀。將復篩后效價較高的突變株在斜面培養基上進行5次傳代培養。將每次傳代的菌株接入發酵培養基進行發酵培養，28℃培養48 h，其產甘油能力結果見表1。由表1可知，突變株GY-1具有較好的遺傳穩定性，甘油產量基本穩定在0.40%左右，經過5次的傳代培養，其產甘油能力有稍微下降的趨勢，可能是由于細胞在繁殖的過程中發生自發突變造成的。

表1 突變菌株GY-1的傳代穩定性Table 1 Genetical stability of the mutant strain GY-1

2.6 突變菌株GY-1的發酵性能分析

2.6.1 突變菌株GY-1在葡萄汁中的生長情況

發酵速率曲線反應了發酵強度的動態變化。發酵過程中每隔24 h稱CO2質量，計算CO2累積質量損失，繪制發酵速率曲線如圖7所示。

圖7 出發菌株GF-23與突變菌株GY-1的發酵速率變化Fig.7 Changes of fermentation rate of original strain GF-23 and mutant strain GY1

由圖7可知，原始菌株GF-23的發酵速率慢于突變菌株GY-1，這表明誘變菌株GY-1對葡萄汁的適應能力強，發酵強度大。兩株菌的變化趨勢相同，說明誘變不會改變葡萄汁有孢漢遜酵母菌株的生長趨勢，只對代謝產物的積累有一定的影響。在葡萄汁中發酵1～2 d時，CO2累計失質量增加，原因是在發酵初期能量充足，葡萄汁有孢漢遜酵母將葡萄糖等能量物質轉化為甘油和其他的一些酯類代謝物；在發酵2～4 d過程中，CO2累計失質量不斷減少，原因可能是在發酵過程中營養物質被消耗，代謝減慢；在發酵4～6 d時，呈現先上升后下降的趨勢，可能是在發酵過程中前期的代謝產物會影響發酵的速率，使代謝加強，之后由于中間代謝產物的消耗使發酵液中生成穩定的代謝產物，而發酵速率下降。

2.6.2 葡萄汁中突變菌株GY-1的甘油發酵性能分析

發酵1～6 d，每隔1 d測定葡萄酒中甘油的產量，結果見圖8。測定發酵葡萄酒中殘糖、酒精度和甘油含量，結果見表2。

圖8 出發菌株GF-23與突變菌株GY-1甘油產量的比較Fig.8 Comparison of glycerin yield of original strain GF-23 and mutant strain GY1

由圖8可知，誘變菌株在葡萄酒中產甘油能力始終高于原始菌株，誘變菌株GY-1的產甘油能力隨發酵時間變化不大，說明甘油在葡萄汁發酵的初期大量產生。誘變菌株GY-1在發酵1 d時甘油產量為0.42%，發酵2 d時甘油產量為0.44%，發酵3 d時甘油產量為0.46%，發酵6 d時甘油產量為0.49%，是原始菌株GF-23的4.45倍，發酵4～5 d，甘油含量變化不大，基本保持穩定，說明甘油在發酵初期產生。

表2 出發菌株GF-23與突變菌株GY-1的發酵性能比較Table 2 Comparison of fermentation performance of original strain GF-23 and mutant strain GY1

由表2可知，兩株菌殘糖含量都較低，說明都能進行正常發酵；誘變菌株GY-1殘糖含量低于原始菌株GF-23，為3.03 g/L，說明發酵完全，充分地將葡萄糖轉化為甘油；兩株菌的酒精度相差不大，由于在葡萄酒發酵的不同時期，酵母菌株的分布存在很大的差異，發酵前期葡萄汁有孢漢遜酵母是優勢酵母菌，隨著發酵進行釀酒酵母逐漸占據優勢地位，將葡萄糖轉化為乙醇，發酵后期產生一定體積的乙醇，由于誘變菌株GY-1產生的甘油含量高于原始菌株，利用的葡萄糖較多，所以產生較低含量的乙醇。在發酵過程中甘油的轉化率較高，說明該菌株可以很好的將葡萄糖轉化為甘油，使葡萄酒中殘糖含量較低，提高了葡萄酒的品質。

3 結論

通過對葡萄汁有孢漢遜酵母原始菌株GF-23甘油的合成代謝途徑進行分析并提出育種策略。根據分析結果，出發菌株GF-23經過多輪誘變選育獲得突變菌株GY-1。突變菌株GY-1的耐氯化鈉質量濃度達到50 g/L，在YPD培養基中培養2 d時，甘油產量為0.44%，是出發菌株的3.33倍；接種在葡萄汁中發酵6 d后，甘油產量達到0.49%，是出發菌株的4.45倍。葡萄發酵液中的殘糖量為3.03 g/L，酒精度為3.86%vol。充分說明該突變菌株具有較好的耐高滲和產甘油能力，可作為紅葡萄酒釀造的混合發酵菌種。