響應面法優化酶解紅松松仁粕制備抗氧化肽

包怡紅，王 鑾，李 倩，蔣士龍*

（1.東北林業大學 林學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江飛鶴乳業有限公司，北京 100015）

有報道證實，抗氧化肽具有抗衰老、抗誘導及抑制腫瘤生長等生物活性[1-2]。而天然抗氧化肽比合成的食品抗氧化劑更加安全可靠，將天然抗氧化肽作為合成抗氧化劑的替代品已越來越引起人們的興趣。因此，抗氧化肽已不僅在食品工業，而且在醫藥、化妝品等領域中都廣泛受到關注[3]。東北紅松松仁粕是松仁經過提油后的副產物，其中蛋白質含量較高，氨基酸組成齊全，是一種優良的抗氧化肽源[4]。選擇適當的蛋白酶將其蛋白質進行酶解，可以得到大量的具有各種生理功能的肽類[5]，其不僅具有廣泛的活性和多樣性，而且能提供人體生長發育所需的營養物質，安全性好、容易吸收[6]。

綦蕾等[7]利用Alcalase 2.4 L堿性蛋白酶酶解紅松松仁制備抗氧化活性肽，其最佳酶解條件中底物質量分數為0.6%。趙玉紅等[8]利用Alcalase 2.4 L堿性蛋白酶酶解紅松松仁制備肽，其最佳酶解條件中底物質量分數為6%。所利用的底物濃度相對較低，考慮到生產成本以及前期處理和后期分離濃縮的困難，應盡量提高酶解時的底物濃度[9]。針對這種情況，本試驗以松仁粕為原料，酶解高濃度的松仁粕制備抗氧化肽，并對多肽的體外抗氧化活性進行研究，不僅節約了原料、降低了成本，還為紅松松仁的資源開發和應用提供基礎科學依據和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

東北紅松松仁粕（蛋白質含量32.48%，脂肪含量38.52%，總糖含量36.14%）：黑龍江省勃利林業局提供；福林酚試劑（分析純）：天津市光復精細化工研究所；酸性蛋白酶（80 000 U/g）：上海卡邁舒生物工程有限公司；堿性蛋白酶（100 000 U/g）：邢臺市萬達生物工程有限公司；中性蛋白酶（50 000 U/g）：濟南市和美生物工程有限公司；其他所有試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

DK-98-1電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；PB-10標準型酸度計：上海精密儀器儀表有限公司；JJ-1精密增力電動攪拌器：常州國華電氣有限公司；ALPHAI-2真空冷凍干燥機：德國Christ公司；DHG-9240電熱恒溫鼓風烘箱：上海恒科有限公司；TGL-16G離心機：上海安亭科學儀器；TDL-5-W臺式離心機：湖南星科科學儀器有限公司；RT-6000酶標分析儀：深圳雷杜生命科學儀器有限公司；722型可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；AT-261電子分析天平：北京賽多利斯儀器系統有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酶解工藝流程

1.3.2 酶的選擇

分別選用酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶，在相應最佳條件下對6%松仁粕漿料進行酶解，反應結束后，100℃沸水浴15 min滅酶，4 000 r/min離心10 min，以水解液的水解度（degree of hydrolysis，DH）和總還原能力為考察指標，確定最佳酶制劑。

1.3.3 單因素試驗

以總還原力、水解度作為評價指標，分別研究酶解pH（8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0）、酶解溫度（40 ℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃）、酶添加量（2 000 U/g、4 000 U/g、6 000 U/g、8 000 U/g、10 000 U/g、12 000 U/g、14 000 U/g松仁粕）、酶解時間（30 min、40 min、50 min、60min、70min、80min、90min、100min）、底物質量分數（5%、7%、9%、11%、13%、15%、17%、19%、21%）5個因素對松仁粕抗氧化肽酶解工藝的影響。

1.3.4 響應面優化試驗

在單因素試驗的基礎上，以酶解溫度（A）、酶解pH（B）、酶添加量（C）為影響因素，以總還原力（Y）作為考察指標，進行優化試驗，得出制備抗氧化肽的最佳工藝。響應面試驗因素與水平見表1。

表1 松仁蛋白粕酶解條件優化響應面試驗因素與編碼水平Table 1 Factors and coded levels of response surface methodology for pine nut protein meal hydrolysis conditions optimization

1.3.5 測定方法

酶活力：按照參考文獻[10]的方法進行測定；水解度：按照參考文獻[11]的方法進行測定；總還原力的測定：按照參考文獻[12]的方法進行測定。

羥基自由基清除能力：按照參考文獻[13]的方法進行測定；2'-聯氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid），ABTS）自由基清除能力：按照參考文獻[14]的方法進行測定；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力：按照參考文獻[15]的方法進行測定。

2 結果與分析

2.1 酶的選擇

3種酶在相同酶活力條件下，分別對松仁蛋白粕進行酶解，測定水解液的水解度和總還原力，結果見表2。

表2 不同蛋白酶對松仁蛋白粕酶解的影響Table 2 Effects of different protease on hydrolysis of pine nut protein meal

由表2可知，3種酶中堿性蛋白酶的水解度最高，為23.82%；總還原力吸光度值也最高，為0.57；因此后續試驗選擇使用堿性蛋白酶。

2.2 東北紅松松仁粕酶解制備抗氧化肽的單因素試驗

2.2.1 酶解pH對松仁蛋白粕酶解的影響

質量分數為6%的松仁粕漿料，調節溫度至55℃，分別調節酶解pH至8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0，加入堿性蛋白酶6 000 U/g松仁粕，在恒溫磁力攪拌器上反應60 min后，終止酶反應，考察酶解pH對水解度和總還原力的影響，結果見圖1。

圖1 酶解pH對松仁蛋白粕酶解的影響Fig.1 Effect of enzymolysis pH on hydrolysis of pine nut protein meal

由圖1可知，水解度隨著酶解pH的升高而增加，在pH值為9.0時達到最大值，之后水解度急劇下降，這是因為酶變性導致活性下降，此時對酶解反應不利。總還原力隨酶解pH的升高呈現先上升后下降的趨勢，在酶解pH值為9.0時達到最大，吸光度值為0.402。該結果說明，酶解物的水解度高并不代表酶解物的抗氧化能力強。由此可知，酶解物的抗氧化活性與肽的結構氨基酸組成有關[16]，初步確定最佳酶解pH為9.0。

2.2.2 酶解溫度對松仁蛋白粕酶解的影響

質量分數為6%的松仁粕漿料，調節pH至9.0，分別調節酶解溫度至40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃，加入堿性蛋白酶6 000 U/g松仁粕，在恒溫磁力攪拌器上反應60 min后，終止酶反應，考察酶解溫度對水解度和總還原力的影響，結果見圖2。

圖2 酶解溫度對松仁蛋白粕酶解的影響Fig.2 Effect of enzymolysis temperature on hydrolysis of pine nut protein meal

由圖2可知，水解度隨酶解溫度的升高而增加，在酶解溫度為55℃時達到最大值，繼續升高酶解溫度，水解度呈下降趨勢，可能是因為溫度過高酶解作用受到限制。總還原力隨酶解溫度的升高呈現先上升后下降的趨勢，在酶解溫度為60℃時達到最大，吸光度值為0.455。初步確定最佳酶解溫度為60℃。

2.2.3 酶添加量對松仁蛋白粕酶解的影響

圖3 酶添加量對松仁蛋白粕酶解的影響Fig.3 Effects of enzyme addition on hydrolysis of pine nut protein meal

質量分數為6%的松仁粕漿料，調節酶解溫度至60℃，pH至9.0，分別加入堿性蛋白酶2000U/g、4000U/g、6000U/g、8 000 U/g、10 000 U/g、12 000 U/g、14 000 U/g松仁粕，在恒溫磁力攪拌器上反應60 min后，終止酶反應，考察酶添加量對水解度和總還原力的影響。

由圖3可知，水解度隨著酶添加量的增加呈先增加后趨于平緩的趨勢，在酶添加量為8000U/g時達到最大值。總還原力隨著酶添加量的增加先增大，當酶添加量為8000U/g時達到最大值，吸光度值為0.495，之后逐漸下降。可能是因為水解程度過大，使具有還原能力的肽水解成不具有還原能力的肽或徹底水解成氨基酸。初步確定酶添加量為8000U/g。

2.2.4 酶解時間對松仁蛋白粕酶解的影響

質量分數為6%的松仁粕漿料，調節酶解溫度至60℃，pH至9.0，加入堿性蛋白酶8 000 U/g松仁粕，在恒溫磁力攪拌器上分別反應30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min、100 min后，終止酶反應，考察酶解時間對水解度和總還原力的影響，結果見圖4。

圖4 酶解時間對松仁蛋白粕酶解的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on hydrolysis of pine nut protein meal

由圖4可知，水解度在前50 min增長明顯，60 min后增加緩慢，到70 min時趨于平緩，說明酶活力已經下降或酶已經被底物飽和。總還原力前60 min增長明顯，從第70 min開始增加緩慢，80 min時吸光度值達到最大值0.604，之后趨于平緩，而當酶解時間延長至100 min時總還原力開始下降，說明隨著水解時間變化，得到的酶解物的結構和長度是不同的，其抗氧化活性就可能會不同。蛋白酶將原先具有還原力的肽段被進一步水解成沒有還原能力的肽段或者是游離的氨基酸，破壞了抗氧化肽的氨基酸結構序列，而酶解物的氨基酸組成分子質量大小與抗氧化性有明顯的相關性[17]。初步確定最佳酶解時間為80 min。

2.2.5 底物質量分數對松仁蛋白粕酶解的影響

分別配制底物質量分數為5%、7%、9%、11%、13%、15%、17%、19%、21%的松仁粕漿料，調節酶解溫度至60℃，pH至9.0，加入堿性蛋白酶8 000 U/g松仁粕，在恒溫磁力攪拌器上反應80 min后，終止酶反應，考察底物濃度對水解度和總還原力的影響，結果見圖5。

圖5 底物質量分數對松仁蛋白粕酶解的影響Fig.5 Effect of substrate mass fraction on hydrolysis of pine nutprotein meal

由圖5可知，水解度和總還原力均隨底物質量分數增大而升高，當底物質量分數為15%時，水解度和總還原力達到最大值，分別為35.41%、0.672。之后隨著底物質量分數繼續增加，水解度和總還原力變化不大，趨于平穩。因為當酶添加量一定時增加底物質量分數，但又未能使酶添加量飽和時，則底物質量分數越大，水解度也越高。考慮盡量提高底物濃度且保證生產成本的情況，所以初步確定底物質量分數為15%。

2.3 東北紅松松仁粕酶解條件優化響應面試驗

松仁粕酶解條件優化響應面試驗結果與分析見表3，方差分析見表4。

表3 松仁蛋白粕酶解條件優化響應面試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of response surface methodology for pine nut protein meal hydrolysis conditions optimization

表4 響應面試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of response surface methodology

由表3、表4可知，以總還原力為響應值的模型中，一次項A、C，二次項A2、B2對總還原力的影響極顯著（P＜0.01），交互項AC對總還原力的影響顯著（P＜0.05）。本實驗所選用的二次多項模型具有極顯著性（P＜0.01），失擬項（P=0.400 0＞0.05）不顯著，其決定系數R2=0.982 0，表明此模型擬合較好，因此可用該回歸方程代替試驗真實點對試驗結果進行分析。

將試驗數據利用Design Expert軟件進行多元回歸擬合，可得到響應值（總還原力）Y和各因子（A、B、C）之間的二次多元方程：Y=-53.70800+1.09483A+4.86750B-0.00019C-0.009 25A2-0.272 5B2-6.843 75E-009C2-0.000 60AB+3.675 00E-006AC+1.15000E-005BC。由方程預測得到最佳酶解條件為酶解pH9.07，酶解溫度62.97℃，加入堿性蛋白酶9999.96U/g松仁粕，在此條件下總還原力為0.699 1。為方便實際操作，修改最佳酶解條件為酶解pH 9.0、酶解溫度63℃、酶解時間80 min、堿性蛋白酶添加量為10 000 U/g松仁粕底物質量分數15%，經驗證得到該條件下，水解物的總還原力為0.69，與預測值接近；此時水解度比優化前提高了2.32%，為36.23%。通過總還原力模型的二次多項回歸方程的響應曲面圖見圖6。

響應曲面坡度相對陡峭，表明響應值對于處理條件的改變非常敏感；若曲面平緩則說明處理條件對響應值影響較小[19]。根據圖6可知，酶解溫度（A）和酶添加量（C）交互作用對水解物總還原力的影響顯著，與表4結果一致。

圖6 酶解溫度、酶解pH與酶添加量交互作用對松仁蛋白粕酶解總還原力影響的響應曲面與等高線Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interactions between hydrolysis temperature,pH and enzyme addition on total reducing power of pine nut protein meal

2.4 抗氧化活性的測定

2.4.1 總還原力的測定

圖7 松仁粕抗氧化肽的總還原力Fig.7 Total reducing power of antioxidant peptides of pine nuts

由圖7可知，松仁粕抗氧化肽在質量濃度較低時，還原能力與VC相比較差；當質量濃度為14 mg/mL時，松仁粕抗氧化肽的還原能力到達同質量濃度VC的71.16%。

2.4.2 松仁粕抗氧化肽對不同自由基的清除作用

圖8 松仁粕抗氧化肽對不同自由基的清除作用Fig.8 Scavenging effect of pine nut meal antioxidant peptide on different free radicals

由圖8可知，松仁粕抗氧化肽對羥基自由基、ABTS自由基、DPPH自由基清除均有較強的清除效果，而且隨著肽質量濃度的增大，其對不同自由基的清除作用均明顯提高。

3 結論

通過試驗確定了堿性蛋白酶為酶解松仁粕的最適合酶，在單因素試驗的基礎上，采用響應面優化得到最佳酶解松仁粕條件為底物質量分數15%、酶解pH 9.0、酶解溫度63℃、酶解時間80 min、酶添加量10 000 U/g，該條件下水解物的總還原力為0.69，水解度為36.23%。相比之前的相關報道底物濃度得到了較大的提高。通過優化后的酶解工藝得到的松仁粕抗氧化肽具有較強的總還原能力，其還原能力隨濃度升高而增強，存在著明顯的劑量依賴關系。當抗氧化肽的質量濃度達到14 mg/mL時，還原能力達到同質量濃度VC的71.16%，而且對羥基自由基、ABTS自由基、DPPH自由基清除率能力均效果顯著。此研究為酶解松仁蛋白粕制抗氧化肽的深入研究提供了理論基礎。