山竹果皮浸泡酒的活性成分及抗氧化活性變化

農仲文，劉曉靜，于立梅*，陳海光

（仲愷農業工程學院 輕工食品學院，廣東 廣州 510225）

山竹（Garcinia mangostana）又叫倒捻子、鳳果、莽吉柿，屬于藤黃科藤黃屬，是一種間雜交的異源多倍體果實，原產地為馬來西亞和印度尼西亞，主要分布于一些東南亞國家（如菲律賓、泰國、越南等），我國廣東、廣西、云南、福建等地也有種植，是一種典型的熱帶水果[1-3]。其果肉淺白而透明，清香爽滑，酸甜可口，可溶性固形物含量為16.8%，碳水化合物含量約為14.3%～15.6%，蛋白質、脂肪、礦物質元素含量豐富，被譽為“果后”[4-5]。果皮呈紫紅色或紫褐色，質量占單個果實鮮質量的52%～68%，是為數不多的幾種厚皮果實之一[6]。山竹主要以果肉作為食用部分，果皮一般不用于食用，但由于果皮中含有大量的果膠和粗纖維及豐富的植物多酚類物質，具有非常高的藥用價值，因而被廣泛應用于腹痛、腹瀉、痢疾、化膿、感染性創傷等疾病的治療[7-8]。隨著生活水平的提高，人們越來越重視食品中的天然成分對人體健康的作用。浸泡酒是一種傳統的酒類加工工藝，由于其制作方便，易于保存，一直以來得到十分廣泛的應用。據中醫藥理分析，酒具有通血脈的作用，山竹浸泡酒可使山竹果皮與酒的效用協同發揮。

本試驗以山竹果皮為原料，研究浸泡過程中多酚、黃酮、色度、花色苷等活性物質含量的動態變化，并以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力和鐵離子還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）為評價指標，探討山竹果皮浸泡酒浸泡期間抗氧化能力變化規律，以期能制備出一種能夠清除人體內多余自由基的浸泡酒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

山竹：市售。

1.1.2 試劑

二鍋頭酒（酒精度55%vol）：北京市新京釀酒廠；福林酚試劑、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、三吡啶基三嗪（2,4,6-tris（2-pyridyl）-1,3,5-triazine，TPTZ）、蕓香葉苷標準品（純度＞98%）：美國Sigma公司；無水乙醇、濃硫酸、苯酚、冰乙酸、甲醇、乙酸乙酯、香草醛（均為分析純）：廣州一碼生物科技公司

1.2 儀器與設備

DK-S22電熱恒溫水浴鍋：廣東環凱微生物科技有限公司；DGSB/20-002A臺式干燥箱：重慶試驗設備廠制造；WFZ800-D3B紫外分光光度計：上海匯質精密儀器有限公司；SHB-3循環水多用真空泵：鄭州杜甫儀器廠；JJ-2B組織搗碎機：常州德杜儀器精密儀器有限公司；PH-3C數字型酸度計：上海雷磁儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 浸泡方法

將山竹果皮和果肉分離，果皮均勻切片（5 cm×3 cm），分為兩份（一份為鮮樣，另一份45℃烘箱中烘至質量恒定），不同前處理的果皮分別放入細口瓶中，用白酒浸泡，加蓋密封后25℃避光貯存。定期檢測酒樣多酚、黃酮、花色苷含量、色度及DPPH自由基清除率和鐵離子還原力。取樣時間間隔1 d。

1.3.2 測定方法

多酚含量[9-10]：移取0.5 mL稀釋至一定倍數的樣品液，樣品液中加入試劑，并在波長760 nm處測定吸光度值。利用繪制的標準曲線計算樣品液中所含的多酚含量。樣品中的多酚含量以每毫升浸泡酒中所含沒食子酸微克數計。

色度的測定[8，11]：移取約4 mL樣品液于比色皿中，以蒸餾水為空白，分別于波長420 nm、520 nm處測定吸光度值，色度值=A420nm+A520nm。

黃酮的測定[12]：精確稱取0.01 g蘆丁溶解于無水乙醇中并定容至10 mL，得到質量濃度為1 mg/mL的蘆丁標準液。分別吸取蘆丁標準溶液0、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL于5 mL比色管中，分別加入體積分數30%的乙醇溶液定容至2.5 mL，再加入5%亞硝酸鈉溶液0.15 mL，混勻后放置5min，加入10%硝酸鋁溶液0.15mL，搖勻，放置6min后再加入1 mol/L NaOH溶液1 mL，用體積分數30%的乙醇溶液定容至5 mL，混勻，靜置15 min，于波長510 nm處測定吸光度值。以蘆丁含量（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標繪制標準曲線，標準曲線為y=0.273x+0.028。移取1 mL樣品液，將樣品液加入試劑，于波長510 nm波長處測定吸光度值并根據蘆丁標準曲線計算出黃酮含量。

花色苷含量的測定：參考文獻[13]的方法并做了修改。將樣品液分別用pH1.0與pH4.5的緩沖溶液稀釋至適當的倍數，避光放置15 min。分別于波長510 nm、700 nm處測定吸光度值，以蒸餾水作為空白。計算樣品液中花色苷含量，其計算公式如下：

式中：A為吸光度值差值；M花色苷相對分子質量，449.2，mg/mol；n=為樣品液的稀釋倍數；ε為花色苷摩爾吸光系數，26 900。

DPPH自由基清除率[14]：準確移取樣品液0.2 mL，加入DPPH標準溶液4 mL，對照用0.2 mL酒精度55%vol的白酒代替樣品液，準確反應20 min，以無水乙醇作為空白，于波長517 nm處測定吸光度值，計算樣品的DPPH清除率，其計算公式如下：

式中：Ai為0.2 mL樣品液加4 mL DPPH標準液的吸光度值；Aj為0.2 mL樣品液加4 mL無水乙醇的吸光度值；Ao為0.2 mL酒精度55%vol白酒加4 mL DPPH標準液的吸光度值。

鐵離子還原能力[15-16]：準確稱取0.278 g FeSO4·7H2O，用蒸餾水溶解并定容至100 mL，得到濃度為10 mmol/L的FeSO4溶液，從溶液中分別移取1mL、2mL、4mL、6mL、8mL、10 mL并分別定容至100 mL，即得到濃度為0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L的FeSO4溶液。分別移取0.1mL各濃度的標準液，加入0.3mL蒸餾水與3 mL鐵離子還原能力測定工作液，混勻，置于37℃水浴中保溫10min，于波長593nm處測定吸光度值，空白用蒸餾水代替標準液。以Fe2+含量（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標繪制標準曲線，標準曲線為y=0.644x-0.018。準確移取稀釋至一定倍數的待測樣液0.1 mL，按照標準曲線繪制的方法加入試劑，于37℃水浴保溫10 min，于波長593 nm處測定吸光度值。樣品FRAP還原能力以達到同樣吸光度值所需的FeSO4的毫摩爾數表示。

1.3.3 數據分析

每個試驗測定重復3次，獲得平均值和標準偏差。應用SPSS 19.0軟件對所有試驗最終數據進行分析，檢驗差異顯著性（P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著）。

2 結果與分析

2.1 活性物質的變化

2.1.1 山竹果皮浸泡過程中多酚含量的變化

圖1 不同處理的山竹果皮浸泡過程中多酚含量的變化Fig.1 Changes of polyphenols contents during the soaking process of mangosteen peel with different treatments

由圖1可以看出，隨著浸泡時間的延長，鮮樣品及烘干樣品浸泡酒中的多酚含量逐漸上升，第7天后上升速度趨勢較平緩。因為原料顆粒溶質的溶解擴散有一定的速度，隨著浸提時間的延長，固液兩相中的多酚含量逐漸趨于平衡。7～9d多酚含量的變化平緩，主要是由于浸泡時間越長，溶劑滲透原料越充分，溶出量越大。經過7d的浸泡，大部分多酚基本溶出，鮮樣品浸泡酒中多酚含量由26.02 μg/mL升至453.45 μg/mL，提高了427.43 μg/mL；烘干樣品浸泡酒中多酚含量由45.81 μg/mL升至480.82 μg/mL，提高了435.01 μg/mL。使用烘干樣品浸泡的多酚含量始終高于鮮樣浸泡。因此，選用烘干樣品浸泡7 d，酒的多酚含量較高。2.1.2山竹果皮浸泡過程中花色苷含量的變化

圖2 不同處理的山竹果皮浸泡過程中花色苷含量的變化Fig.2 Changes of anthocyanin contents during the soaking process of mangosteen peel with different treatments

由圖2可以看出，浸泡酒中的花色苷含量隨著浸泡時間的延長增加，當浸泡3 d時溶出量達到最佳，此時鮮樣品浸泡酒中花色苷含量為1.43 mg/L，烘干樣品浸泡酒中花色苷含量為1.76 mg/L。繼續延長浸泡時間，鮮樣品浸泡酒中的花色苷含量在7 d下降幅度大，說明鮮樣花色苷不穩定，易受到溫度、光照等因素影響而改變，因此隨著浸提時間增加，酒中花色苷含量增加，但浸提時間過長，溶解到酒中的花色苷受到外界環境的影響，則會發生分解、轉化，從而導致其含量下降；烘干樣品浸泡酒的花色苷含量在浸泡3 d后略有下降，但一直都高于鮮樣品浸泡酒中花色苷含量，因此，選用烘干樣品浸泡3 d，酒的花色苷含量較高。

2.1.3 山竹果皮浸泡過程中黃酮含量的變化

圖3 不同處理的山竹果皮浸泡過程中黃酮含量的變化Fig.3 Changes of flavonoid contents during the immersing process of mangosteen peel with different treatments

由圖3可以看出，浸泡酒中的黃酮含量隨著浸泡時間的延長增加，在浸泡前3天黃酮含量變化顯著，此后3～7 d黃酮含量變化不顯著（P＞0.05），當浸泡時間達到7 d時，鮮樣品的黃酮量為1.94 mg/mL，烘干樣品為2.43 mg/mL，浸泡9 d后黃酮含量略有下降。因此，選用烘干樣品浸泡7 d，酒的黃酮含量較高。

2.1.4 山竹果皮浸泡過程中酒色度的變化

圖4 不同處理的山竹果皮浸泡過程中酒色度值的變化Fig.4 Changes of chromaticity value during the soaking process of mangosteen peel with different treatments

由圖4可以看出，酒的色度值隨浸泡時間延長而升高，當浸泡5d時酒色度值達到最高，鮮樣品色度值為0.32，烘干樣品色度為0.34；繼續延長浸泡時間，酒的色度稍有下降。色度值反映的是酒所呈現的顏色，主要由酚類物質花色苷、單寧含量決定，同時受酒液pH等其他因素的影響[17]。結合活性物質的溶出量，可以看出，色度值與多酚、黃酮、花色苷溶出量的變化趨勢相似，說明浸出物含量少時，多酚、單寧浸出量少，酒體顏色較淺。因此，選用烘干樣品浸泡5 d，酒的色度較好。

從兩種樣品浸泡酒的多酚、花色苷和黃酮含量變化來看，烘干樣品并不會使原料中的活性物質減少，反而稍高。黃酮與多酚都是醇溶性物質，容易溶解于乙醇中而被提取出來。由于黃酮與多酚一樣具有清除自由基和對抗各種心腦血管疾病的效果，而烘干樣品后的黃酮量更多，故認為浸泡前將原料預先進行烘干更好，原料也容易保藏。因此綜合考慮，選用烘干樣品浸泡7 d時活性物質溶出效果較好。

2.2 抗氧化活性

2.2.1 浸泡過程中DPPH自由基清除率變化

圖5 山竹果皮浸泡過程中DPPH自由基清除率變化Fig.5 Changes of DPPH free radical clearing rate during the soaking process of mangosteen peel

由圖5可以看出，在開始浸泡的3 d內，酒中的DPPH自由基清除能力迅速上升，在第3天時鮮樣品的自由基清除率為76.64%，烘干樣品為77.77%；隨著浸泡時間的延長，DPPH自由基清除率趨于穩定，由于浸泡過程中溶出的許多物質（如多酚、黃酮等）都具有抗氧化能力，這些具有抗氧化能力的物質共同作用會使樣品的抗氧化效果增加。故當浸泡時間達到3 d時，樣品中的抗氧化能力已經達到穩定。烘干樣品不會對DPPH清除率造成影響，兩種樣品抗氧化能力無顯著性差異（P＞0.05）。這與酒中多酚、黃酮、花色苷等活性成分含量變化的趨勢一致。因此，為使山竹酒清除DPPH自由基能力較高，選用烘干樣品，浸泡的時間為3 d即可。

2.2.2 浸泡過程中FRAP值的變化

圖6 山竹果皮浸泡過程中FRAP值的變化Fig.6 Changes of FRAP values during the soaking process of mangosteen peel

從圖6可以看出，在浸泡過程中，酒的FRAP值逐漸上升，并在浸泡7 d達到最高值，隨后稍有下降。當浸泡時間達到7 d時，鮮樣品的FRAP值為3.73×10-4mmol，烘干樣品的FRAP值為6.422×10-4mmol。雖然FRAP值與DPPH自由基清除能力一樣反映的是樣品的抗氧化能力，但結合兩幅圖來看，兩種方法得到結果并不同步。也許是由于外界環境或者樣品中存在的其他物質對其中一個方法的效果產生一定的影響，所以會顯示出不一樣的趨勢。因此，選用烘干樣品浸泡7 d較為合適。

上述結果說明山竹酒的抗氧化能力是溶在其中的多酚、黃酮、花色苷等多種活性成分綜合作用的結果。山竹果皮浸泡酒的DPPH自由基清除率與總含量、黃酮含量呈強正相關。烘干樣品DPPH清除率和多酚、黃酮含量的相關系數0.969，0.939。鐵離子還原力與多酚含量、黃酮含量和花色苷含量均呈正相關，相關系數分別為0.723、0.661、0.829。綜合上述實驗結果，烘干的山竹果皮用白酒浸泡7 d后，得到的酒液中主要活性成分含量較高，抗氧化活性較好。

3 結論

山竹果皮富含多種活性成分，山竹浸泡酒可使山竹果皮與酒的效用協同發揮。研究山竹果皮浸泡過程中多酚、黃酮、色度、花色苷等活性物質含量的動態變化及抗氧化活性，可以豐富山竹果的綜合利用。果皮浸泡過程中活性成分溶出量均隨浸泡時間的延長而增加，且烘干樣品效果較好。其中花色苷含量在浸泡3 d時較高，為1.76 mg/L；黃酮、多酚含量在浸泡7 d時較高，含量分別為2.43 mg/mL、480.82 μg/mL；浸泡5 d時酒色度達到最高，為0.34。抗氧化活性實驗結果表明，在浸泡過程中，DPPH自由基清除率在3 d達到穩定，為77.77%，而還原能力在第7天達到穩定，FRAP值為6.422×10-4mmol。山竹酒的抗氧化能力與多酚含量、黃酮含量和花色苷含量均呈正相關。因此，烘干的山竹果皮用白酒浸泡7 d后，得到的酒液中主要活性成分含量較高，抗氧化活性較好。