氯化血紅素比色法檢測(cè)乳制品中土霉素

石 彬，李詠富*，吳遠(yuǎn)根

（1.貴州省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006；2.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

土霉素（oxytetracycline，OTC）又稱5-羥基四環(huán)素、地霉素、地靈霉素、氧四環(huán)素等[1]，作為一種重要的四環(huán)素類抗生素，土霉素具有廣譜抗生活性[2]，對(duì)畜禽類疾病的防治和治療具有很好的效果，在養(yǎng)殖行業(yè)使用廣泛[3]。但由于利益的驅(qū)使，近年來土霉素在養(yǎng)殖行業(yè)存在濫用的現(xiàn)象。目前已經(jīng)有人在水體中檢出了土霉素等類四環(huán)類抗生素，現(xiàn)有技術(shù)無法對(duì)其進(jìn)行有效的處理[4-5]。在我國(guó)，每年有數(shù)千噸土霉素被用于獸藥的生產(chǎn)中。過量的土霉素會(huì)殘留在動(dòng)源性食品中，隨食物鏈進(jìn)入人體，損害人體的皮膚、免疫系統(tǒng)以及造成肝腎損傷等[6]，并可能會(huì)誘導(dǎo)具有超強(qiáng)抗藥性的病菌產(chǎn)生，威脅公共衛(wèi)生安全，對(duì)人類健康造成巨大的威脅[7-10]。為了有效地監(jiān)管土霉素的殘留，許多國(guó)家對(duì)動(dòng)源性食品中土霉素的含量都做出了嚴(yán)格規(guī)定[11-12]。傳統(tǒng)的土霉素檢測(cè)方法主要有微生物檢測(cè)法、色譜檢測(cè)法以及免疫學(xué)方法等。這些方法雖然基本上能夠滿足檢測(cè)的要求，但是存在著耗時(shí)、設(shè)備昂貴、需要標(biāo)準(zhǔn)品、特異性差、樣品前處理繁瑣等不同的缺點(diǎn)[13]，因此建立一種快速、簡(jiǎn)便的新檢測(cè)方法顯得十分重要[14]。

氯化血紅素（hemin）是一種由原卟啉IX與鐵（II）絡(luò)合形成的化合物，具有辣根過氧化物酶活性。在以3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）和雙氧水（H2O2）作為底物時(shí)，可以通過改變氯化血紅素催化活性，使底物因?yàn)槭щ娮忧闆r不同而產(chǎn)生不同顏色的產(chǎn)物。有文獻(xiàn)報(bào)道[15]利用氯化血紅素催化活性成功建立了一種水體三價(jià)砷的比色檢測(cè)方法，分別得到0.6 μg/L和0.77 μg/L兩組最低檢測(cè)限度。本研究將氯化血紅素的催化特性運(yùn)用于土霉素的檢測(cè)，以期建立一種基于氯化血紅素檢測(cè)的土霉素的方法，為快速、簡(jiǎn)便檢測(cè)乳制品中土霉素提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

土霉素、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、氯化血紅素（hemin）：上海生工生物有限公司；雙氧水、TMB（分析純）：Sigma-Aldrich公司；硫酸鏈霉素（streptomycin sulfate，STR）、雙氯芬酸鈉（diclofenac sodium，DIC）、阿莫西林（amoxicillin，AMX）、卡馬西平（carbamazepine，CBZ）、硫酸卡那霉素（kanamycin sulfate，KAN）、青霉素鉀（ben zylpenicillin potassium，PEN）（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；牛奶樣品：內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TUS-200P振蕩型恒溫金屬孵育器：上海一恒科技有限公司；Multiskan GO酶標(biāo)儀：Thermo Fisher Scientific公司；BS124S分析天平：德國(guó)Sartorius公司；SP-701 pH計(jì)：上海志榮電子科技有限公司；CT14RD高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：上海天美科學(xué)儀器有限公司；Eppendorf Research移液槍：德國(guó)Eppendorf公司；NJ75-101-3A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海久濱儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)原理

氯化血紅素（hemin）是人工合成的一種水溶性血紅素的氯化物，在磷酸二氫鈉緩沖溶液中，氯化血紅素具有辣根過氧化物酶活性，在H2O2存在時(shí)可以催化3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）產(chǎn)生不同顏色的產(chǎn)物。當(dāng)氯化血紅素過氧化物酶活性較強(qiáng)時(shí)，底物TMB失去2個(gè)電子，生成黃色產(chǎn)物在波長(zhǎng)450nm處展現(xiàn)特征吸收峰。當(dāng)氯化血紅素的過氧化物酶活性較弱時(shí)，TMB失去1個(gè)電子，生成產(chǎn)物呈藍(lán)綠色，在波長(zhǎng)450 nm處左右沒有特征吸收峰。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)催化反應(yīng)體系中存在土霉素（OTC）時(shí)，氯化血紅素的催化活性受到抑制，導(dǎo)致反應(yīng)產(chǎn)物在波長(zhǎng)450 nm處的吸光度值顯著降低，生成藍(lán)綠色產(chǎn)物。且OTC濃度與產(chǎn)物吸光度值下降的幅度（ΔA450nm）成正比，通過觀察顏色變化或測(cè)定ΔA450nm，實(shí)現(xiàn)對(duì)OTC的定性和定量檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)原理如圖1所示。

圖1 氯化血紅素催化檢測(cè)土霉素原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of hemin catalytic for oxytetracycline detection

1.3.2 OTC含量檢測(cè)條件優(yōu)化

在1.5 mL離心管中，加入5 μL的待測(cè)樣品，30℃恒溫孵育10 min，隨后向體系中加入5 μL不同濃度的氯化血紅素溶液（10 μmol/L、15 μmol/L、17.5 μmol/L、20 μmol/L、22.5 μmol/L、25 μmol/L、30 μmol/L）充分混勻，30 ℃繼續(xù)孵育30 min。隨后向體系中加入不同pH值的磷酸二氫鈉溶液（pH3.0、pH3.5、pH4.0、pH4.5、pH5.0）定容至500 μL。充分混勻后，向體系中加入10 μL H2O2與10 μL TMB溶液，混勻，然后分別取200 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白對(duì)照液置于96孔酶標(biāo)板中，測(cè)定波長(zhǎng)450 nm處的吸光度值，獲得其吸收光譜。計(jì)算其在波長(zhǎng)450 nm處與空白樣品吸光度值差值ΔA450nm，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算待測(cè)樣品中OTC含量。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取18支1.5mL離心管，分別加入5μL不同濃度的OTC標(biāo)準(zhǔn)液，使得整個(gè)檢測(cè)體系中的OTC含量維持在0～400nmol/L，30℃恒溫孵育10min，隨后向體系中加入5μL優(yōu)化后的氯化血紅素溶液充分混勻，30℃繼續(xù)孵育30min。隨后向體系中加入優(yōu)化后磷酸二氫鈉緩沖溶液至500μL。充分混勻后，向體系中加入10 μLH2O2與10 μLTMB溶液，混勻，然后分別取200μL標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白對(duì)照液置于96孔酶標(biāo)板中，測(cè)定波長(zhǎng)450nm處的吸光度值，獲得其吸收光譜。以不同濃度的土霉素測(cè)定的ΔA450nm（不同濃度樣品的吸光度值-空白樣品的吸光度值）作圖，做三組平行，取平均值，繪制OTC標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 牛奶樣品預(yù)處理

取100mL牛奶樣品加入NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8，充分混勻后超聲5min，隨后加入2%的三氯乙酸以消除鈣離子的影響。混合物加入離心管中，8000r/min、4℃低溫離心15min。取上清液，過濾，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 OTC含量檢測(cè)條件優(yōu)化

2.1.1 催化體系檢測(cè)可行性分析

對(duì)氯化血紅素檢測(cè)方法的可行性進(jìn)行了研究。按照1.3.2的方法，選取5組不同催化條件，檢測(cè)其在3 min時(shí)，波長(zhǎng)300～800 nm范圍內(nèi)的吸光度圖譜，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同催化條件對(duì)氯化血紅素催化反應(yīng)的影響Fig.2 Effects of different catalytic conditions on hemin catalytic reaction

由圖2可知，當(dāng)催化體系中不存在抗生素類物質(zhì)時(shí)，氯化血紅素的催化能力較強(qiáng)，反應(yīng)產(chǎn)物在波長(zhǎng)450 nm處的吸光度值達(dá)到1.4，生成產(chǎn)物顏色呈黃色；當(dāng)體系中存在硫酸鏈霉素（STR）和雙氯芬酸鈉（DIC）時(shí)，A450nm顯有下降，下降的幅度不明顯，生成產(chǎn)物顏色偏黃色。當(dāng)體系中存在OTC時(shí)，A450nm顯著降低，生成產(chǎn)物偏藍(lán)綠色。且200 nmol/L OTC體系的A450nm下降幅度明顯大于100 nmol/L OTC體系，反應(yīng)產(chǎn)物顏色也更綠。結(jié)果表明OTC能夠有效降低氯化血紅素的催化活性，且氯化血紅素催化活性下降幅度與OTC濃度成正比，反應(yīng)具有較好的特異性。

2.1.2 氯化血紅素濃度的選擇

在催化檢測(cè)體系中，氯化血紅素濃度是重要決定因素。通過氯化血紅素濃度的優(yōu)化，能夠提高反應(yīng)檢測(cè)靈敏度，達(dá)到檢測(cè)差異最大化。按照1.3.2的方法，采用單因素法，固定其他條件不變，分別選擇氯化血紅素濃度為10 μmol/L、15 μmol/L、17.5 μmol/L、20 μmol/L、22.5 μmol/L、25 μmol/L、30μmol/L，檢測(cè)并計(jì)算各組樣品的吸光度值差值ΔA450nm。檢測(cè)時(shí)間間隔1min，檢測(cè)時(shí)間10min，最大吸光度值差值記為ΔA450nmmax，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同氯化血紅素濃度對(duì)催化反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of different hemin concentration on catalytic reaction

由圖3可知，除了濃度30 μmol/L的氯化血紅素催化體系外，其他濃度的氯化血紅素體系反應(yīng)產(chǎn)物ΔA450nm均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而先上升，達(dá)到峰值ΔA450nmmax后開始下降；當(dāng)氯化血紅素濃度＜20 μmol/L時(shí)，濃度尚未飽和；隨著氯化血紅素濃度的升高，ΔA450nmmax的值逐漸增大；當(dāng)氯化血紅素濃度＞20 μmol/L時(shí)，濃度達(dá)到飽和，由于電荷相互影響分子聚集等原因，隨氯化血紅素濃度升高，ΔA450nmmax的值逐漸減小。當(dāng)體系氯化血紅素濃度為20 μmol/L時(shí)，產(chǎn)物ΔA450nmmax的值達(dá)到最大，檢測(cè)差異最明顯；30μmol/L的氯化血紅素由于濃度過大，導(dǎo)致催化反應(yīng)產(chǎn)物ΔA450nm在1 min內(nèi)已經(jīng)達(dá)到峰值；因此最終選擇氯化血紅素濃度20μmol/L為最優(yōu)檢測(cè)濃度。

2.1.3 反應(yīng)體系pH選擇

pH變化對(duì)任何反應(yīng)體系都有很大的影響，直接影響反應(yīng)體系中分子的電離情況，pH過高或者過低，都不利于催化反應(yīng)的進(jìn)行。按照1.3.2的方法，固定其他條件不變，選擇pH3.0、pH3.5、pH4.0、pH4.5、pH5.0的磷酸二氫鈉緩沖液，檢測(cè)并計(jì)算各組樣品的吸光度值差值ΔA450nm。檢測(cè)時(shí)間間隔1min，檢測(cè)時(shí)間10min，最大吸光值差值記為ΔA450nmmax，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同反應(yīng)體系pH值對(duì)催化反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of different pH value on catalytic reaction

由圖4可知，隨著時(shí)間的增加，ΔA450nm的值先升高，達(dá)到峰值后開始下降。當(dāng)pH為3.0時(shí)，ΔA450nm在反應(yīng)8 min左右達(dá)到最大值為0.39；當(dāng)pH為3.5時(shí)，ΔA450nm在4 min時(shí)達(dá)到最大值為1.05；當(dāng)pH分別為4.0、4.5和5.0時(shí)，ΔA450nm分別在反應(yīng)3 min、3 min和2 min時(shí)達(dá)到最大值，分別為0.80、0.59和0.21。結(jié)果表明，在一定pH范圍內(nèi)，隨著體系磷酸二氫鈉緩沖液pH的升高，ΔA450nm達(dá)到峰值的時(shí)間逐漸縮短；pH值為3.5時(shí)，ΔA450nmmax達(dá)到峰值，催化產(chǎn)物檢測(cè)差異達(dá)到最大。pH值過高或過低時(shí)，催化體系中分子基團(tuán)的電離情況發(fā)生變化，催化活性發(fā)生改變，檢測(cè)差異變小。故最終選擇pH 3.5為體系最優(yōu)pH值。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

根據(jù)優(yōu)化的結(jié)果，選擇氯化血紅素濃度為20 μmol/L，磷酸二氫鈉緩沖液pH為3.5，在0～400nmol/L范圍內(nèi)選擇不同濃度的OTC標(biāo)準(zhǔn)品，按照1.3.3的方法，對(duì)其在波長(zhǎng)450nm處的吸光度值進(jìn)行檢測(cè)。以O(shè)TC的濃度（C）為橫坐標(biāo)，ΔA450nm（Y）為縱坐標(biāo)，繪制OTC標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖5所示。

圖5 土霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of oxytetracycline

由圖5可知，在OTC濃度在0～400nmol/L范圍內(nèi)，ΔA450nm與OTC濃度符合Logistic模型，具有良好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.997。在低濃度25～90 nmol/L的范圍內(nèi)，ΔA450nm與OTC濃度呈良好的線性關(guān)系，擬合方程為Y=1.04×10-3C+0.0622。由公式計(jì)算出最低檢測(cè)限度為21.89 nmol/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于歐盟和美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（food and drug administration，F(xiàn)DA）對(duì)牛奶中OTC的最大殘留限量。

2.3 檢測(cè)特異性研究

檢測(cè)特異性考查檢測(cè)方法的一個(gè)重要指標(biāo)。為證實(shí)氯化血紅素催化檢測(cè)體系對(duì)OTC具有特異性的識(shí)別能力，即檢測(cè)的特異性，考查了其他競(jìng)爭(zhēng)性抗生素土霉素（OTC）、雙氯芬酸鈉（DIC）、硫酸鏈霉素（STR）、阿莫西林（AMX）、硫酸卡那霉素（KAN）、青霉素鉀（PEN）這6不同種類的抗生素對(duì)檢測(cè)體系的干擾情況。按照1.3.2的方法。分別向檢測(cè)體系中加入200 nmol/L和100 nmol/L的不同種類的抗生素，測(cè)定其與空白樣品在波長(zhǎng)450 nm處的吸光度值差值ΔA450nm。以4 min時(shí)不同樣品的ΔA450nm值作柱狀圖，結(jié)果如圖6、圖7所示。

圖6 200 nmol/L不同種類抗生素對(duì)土霉素檢測(cè)的影響Fig.6 Effect of different antibiotics with concentration of 200 nmol/L on the detection of oxytetracycline

圖7 100 nmol/L不同種類抗生素對(duì)土霉素檢測(cè)的影響Fig.7 Effect of different antibiotics with concentration of 100 nmol/L on the detection of oxytetracycline

由圖6可知，當(dāng)OTC存在時(shí)，ΔA450nm的值最大，為1.26，顯著高于其他抗生素；從反應(yīng)顏色上判斷，當(dāng)體系加入200 nmol/L OTC時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物呈藍(lán)色，而加入其他抗生素時(shí)則呈黃色。由圖7可知，加入100nmol/LOTC時(shí)，產(chǎn)物的ΔA450nm為1.02，低于OTC濃度為200 nmol/L的體系，明顯高于其他種類的抗生素。當(dāng)體系加入100 nmol/L OTC時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物呈藍(lán)綠色，而加入100 nmol/L的其他抗生素則呈黃色。表明該體系對(duì)OTC檢測(cè)具有良好的選擇性。

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

按照1.3.4的方法對(duì)牛奶樣品進(jìn)行前處理，在空白牛奶樣品中添加不同濃度的OTC標(biāo)準(zhǔn)液（50 nmol/L、80 nmol/L、100nmol/L、200nmol/L）。在最優(yōu)條件下，測(cè)定4組不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)物波長(zhǎng)450 nm處的吸光度值，每個(gè)濃度樣品重復(fù)測(cè)定3次，測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 牛奶樣品中土霉素加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of adding standard recovery rate of oxytetracyclinein milk samples

由表1可知，其平均加標(biāo)回收率范圍為90.50%～107.55%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為1.39%～4.02%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，根據(jù)實(shí)際檢測(cè)量所計(jì)算出的該方法的平均加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在殘留實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則允許的范圍之內(nèi)，具有良好的重復(fù)性和準(zhǔn)確度，符合抗生素殘留量分析和檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)要求，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)OTC殘留有效檢測(cè)。

3 結(jié)論

利用氯化血紅素的辣根過氧化物酶活性建立了一種新的OTC的快速檢測(cè)方法。該方法具有快速、靈敏、操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好的特點(diǎn)，可用于乳制品中OTC的快速比色檢測(cè)。

在氯化血紅素濃度為20 μmol/L，pH值為3.5條件下，反應(yīng)體系檢測(cè)差異性達(dá)到最大，檢測(cè)效果最好。最低檢測(cè)限度為21.89nmol/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國(guó)際上牛奶中OTC的最大殘留限量規(guī)定。該方法對(duì)其他抗生素的抗干擾能力較強(qiáng)，同時(shí)具有良好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，可以對(duì)OTC殘留檢測(cè)進(jìn)行有效檢測(cè)。