BDNF對缺糖缺氧小鼠mPFC腦區GFAP蛋白的影響

喻曉路

徐州醫科大學江蘇省麻醉學重點實驗室，江蘇徐州 221004

星形膠質細胞(astrocyte,AS)是中樞神經系統中數目最多的一種細胞,它作為膠質細胞的主要類別,幾乎囊括了膠質細胞的所有功能[1]。膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)被公認為是AS的標志性蛋白，在感染、創傷、神經退行性疾病等病理條件下，星形膠質細胞被激活，因此，抑制星形膠質細胞過度激活對防治中樞神經系統的疾病有重要意義[2]。BDNF(brain derived neu rotropic factor,腦源性神經生長因子)是一種重要的神經因子，在生理環境下具有促進突觸的形成、維持神經系統的功能[3-6]。mPFC腦區是一個腦內與運動、學習記憶、情緒等功能關系密切的重要腦區，其中就包括神經元和膠質細胞[7]。腦組織的缺糖缺氧是腦缺血患者的主要癥狀之一，其中腦組織中的星形膠質細胞會大量增生，是一種缺血后的全腦保護性防御機制[8]。該次對比了腦片培養技術和細胞培養技術，認為腦片培養技術與細胞培養技術相比更多的保留了細胞和組織結構，能夠更好的模擬生理狀態，并且操作更簡便，對實驗設備的要求也不高[9-10]。該實驗采用腦片培養的方法，目前此方法已經成熟，見圖1，圖中神經元形態清晰。該實驗在2017年12月—2018年2月期間在徐州醫科大學麻醉學重點實驗室將18只小鼠隨機分為3組，對小鼠mPFC腦區的腦片進行缺糖缺氧處理和復灌，并與加入BDNF的處理組進行比較，對GFAP蛋白的表達量進行測定，明確BDNF在缺糖缺氧條件下小鼠mPFC腦區的作用，為腦缺血病患所進行溶栓治療的方法提供有力的實驗依據。

圖1 腦片培養mPFC腦區HE染色20X

1 材料與方法

1.1 主要材料

SPF級昆明小鼠18只，體重25～30 g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，標準化飼養。

1.2 儀器和試劑

材料：BDNF（2837）購自 TOCRIS 公司，RIPA 裂解液（KGP702-100）購自凱基生物公司，低糖DMEM培養基（ABB210359）和 EBSS 培養基（AB10134597）均購自 Hy-Clone公司，青鏈霉素混合液（VC2003）購自VICMED公司，GFAP （12389）一抗購自 Cell Signaling Technology公司，GAPDH（10494）一抗購自 proteintech公司，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗（A0208）和BCA蛋白濃度測定試劑盒（P0009）購自碧云天生物技術有限公司，ECL發光試劑盒 （AC36131）購自bioworld公司，Transwell 24孔板細胞培養小室（3413）購自Corning公司，PVDF膜（IPVH00010）購自Immobilon公司，自動震動切片機購自萊卡公司，化學發光儀購自BIO-RAD公司，其余自配液體試劑均購自sigma公司。

自配溶液：高滲糖溶液Sucrose 254 mM,D-Glucose 10 mM,NaH2PO41.25 mM,NaHCO324 mM,MgSO4·7H2O 2 mM,KCl 3 mM,CaCl2·2H2O 2 mM，用去離子水溶解。使用前通入95%O2+5%CO230 min。

1.3 實驗方法

1.2.1 腦片制備 實驗動物經七氟烷誘導麻醉后，迅速斷頭，然后用剪刀剪開兩耳間的皮膚直至兩鼻間，然后翻轉皮膚，暴露顱骨。用眼科剪去掉小鼠顱骨，暴露全腦。隨后用眼科鑷伸入腦前端下部的嗅球處，輕輕挑起腦的前端，剪斷腦神經，翻轉全腦，放入冰冷、預先通95%O2+5%CO2混合氣 30 min的高滲糖溶液中，放置1～2 min。取出全腦，除去小腦和嗅球，用刀片切取鼠腦前中部，迅速用502膠水將腦組織塊底部粘在自動震動切片機的緩沖槽中，用高滲糖溶液浸沒組織塊，設置自動震動切片機的切片速度、厚度和距離，切取含有mPFC腦區的厚度為300 μm的腦片，大約可以取3～5片，用小刀切去多余組織，只保留mPFC區域，整個過程在8 min內完成，高滲糖溶液溫度維持在4℃。24孔培養板孔內加0.5 mL的腦片培養液，即低糖DMEM培養基，其中包括1%青鏈霉素混合液，將取好的腦片移入Transwell的小室中，盡量完全吸棄高滲糖溶液，將小室放入培養板中，使培養基的液面剛好達到腦片的水平，但不漫過腦片，將培養皿置于37℃培養箱中的自制密閉容器中，自制密閉容器有輸入和輸出氣體的導管。腦片培養基的組成：低糖DMEM+1%的青鏈霉素混合液。腦片的培養條件為：溫度37℃，持續穩定通入95%O2+5%CO2混合氣體，微生物培養箱中培養。要保證腦片的上表面充分暴露于氣體環境中。

1.3.2 充N2法制備腦片缺氧缺糖模型 將缺氧缺糖組的腦片更換為EBSS培養基，并移進充入5%CO2+95%N2混合氣體的密閉容器中，在37℃培養箱中是以0.5 L/min的流量充入混合氣，于15 min后換成低糖培養基并復氧，通入95%O2+5%CO2混合氣體，在37℃培養箱中復灌培養 1 h。

1.3.3 分組 正常組：選取正常昆明小鼠6只，取mPFC腦區，采用低糖DMEM培養基并通入95%O2+5%CO2混合氣體進行培養。

缺糖缺氧復灌組（OGD/R）：選取正常昆明小鼠6只，取mPFC腦區，采用EBSS培養基并通入5%CO2+95%N2混合氣體進行培養15 min，并進行復灌，即將帶有腦片的小室置入加入DMEM培養基的培養皿中，并持續通入95%O2+5%CO2混合氣體1 h。

缺糖缺氧復灌給藥組（OGD/R+BDNF）：選取正常昆明小鼠6只，取mPFC腦區，采用在EBSS培養基中加入BDNF（BDNF 用量為 50 ng/μL）并通入 5%CO2+95%N2混合氣體進行培養15 min，并進行復灌，即將帶有腦片的小室置入加入DMEM培養基的培養皿中，并持續通入95%O2+5%CO2混合氣體1 h。

1.3.4 對檢測樣品的制備和免疫印跡分析 在模型制作完成后，將腦片移入潔凈的EP管中，加入蛋白裂解液，用電動勻漿器將組織打碎，充分裂解組織，4℃10 000轉離心30 min，棄去沉淀，將上清液移入新EP管中，并做好標記。用BCA試劑盒進行蛋白定量，測定蛋白濃度，將樣品配平，按照每孔20 ng的蛋白量進行上樣跑電泳，采用半干轉的方式將膠中的蛋白轉到PVDF膜上，5%的脫脂奶粉封閉 1 h，移入 GFAP（1∶1 000）一抗和 GAPDH（1∶5 000）一抗中4℃過夜，室溫復溫30 min,washing buffer清洗3次，5 min/次，轉入HPR標記的兔二抗中孵育40 min，washing buffer清洗3次，15 min/次。用化學發光儀進行曝光記錄。用ImageJ軟件進行定量分析。

1.4 統計方法

采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據處理，采用單因素方差分析，（one-way ANOVE）進行組間比較，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

正常組GFAP蛋白的相對表達量為 （1.066 33±0.356 753），缺糖缺氧復灌組GFAP蛋白的相對表達量為（2.317 57±0.578 685），缺糖缺氧復灌給藥組GFAP蛋白的相對表達量為（1.377 63±0.0619 96）。通過對正常組、缺糖缺氧復灌組和缺糖缺氧復灌給藥組的小鼠mPFC腦區的GFAP蛋白的表達進行比較，通過蛋白免疫印跡的檢測結果顯示，缺糖缺氧復灌組與正常組相比GFAP蛋白的相對表達量升高，差異有統計學意義（P＜0.05），缺糖缺氧復灌給藥組與缺糖缺氧復灌組相比GFAP的蛋白相對表達量降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。缺糖缺氧復灌給藥組與正常組相比GFAP的蛋白相對表達量差異無統計學意義 （P＞0.05）。 見圖 2。

圖2 GFAP表達水平比較

3 討論

腦部缺糖缺氧是腦缺血病患的主要癥狀，它可以導致人類殘疾或者死亡，眾多的研究表明腦組織的缺糖缺氧會誘發一系列的病理變化，甚至短暫性的缺糖缺氧也會對腦組織造成一定的損傷[8]。腦組織主要由神經元和神經膠質細胞組成，神經膠質細胞的數量是神經元的10～50倍，其中大部分為星形膠質細胞[1-2]。有報道稱BDNF具有神經保護和神經營養的作用，可以幫助神經損傷后傳導功能的恢復。缺糖缺氧對腦組織的損傷尤其表現在星形膠質細胞的大量增生上。mPFC腦區與運動、學習記憶等功能關系密切，此腦區的損傷會影響多個生理功能[7]。在缺糖缺氧的條件下加入BDNF，能有效減緩GFAP蛋白表達量的升高。正常組GFAP蛋白的相對表達量為（1.066 33±0.356 753），缺糖缺氧復灌組GFAP蛋白的相對表達量為（2.317 57±0.578 685），缺糖缺氧復灌給藥組GFAP蛋白的相對表達量為（1.377 63±0.0619 96）。缺糖缺氧復灌組與正常組相比GFAP蛋白的相對表達量升高，差異有統計學意義（P＜0.05），缺糖缺氧復灌給藥組與缺糖缺氧復灌組相比GFAP的蛋白相對表達量降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。缺糖缺氧復灌給藥組與正常組相比GFAP的蛋白相對表達量升高，差異無統計學意義（P＞0.05）。采用建立mPFC腦區腦片缺糖缺氧的模型，很好的模仿了短暫性腦缺血的癥狀，同時加入BDNF的實驗，驗證了BDNF在短暫性缺糖缺氧對mPFC腦區GFAP蛋白的作用，以此說明BDNF可以有效降低GFAP蛋白的表達量，抑制星形膠質細胞的活化，減少炎性因子的釋放，從而減少神經元的損傷[11]。

現有報道顯示BDNF作為一種重要的腦源性神經生長因子對于腦內神經元都起到很好的保護和營養作用，其中也包括mPFC腦區，在慢性病理性疼痛下大鼠的mPFC內的BDNF表達量升高[12]。而對GFAP蛋白在mPFC的研究僅限于抑郁癥等精神類疾病的研究上，文獻報道中提到的腦卒中后抑郁癥條件下BDNF和GFAP均有影響[13-14]。對于由于腦缺血所造成的缺糖缺氧癥狀而引起的星形膠質細胞增多，從而造成神經元的損傷方面卻沒有研究，該研究正好填補了這一空白。

綜上所述，BDNF在小鼠mPFC腦區缺糖缺氧條件下，GFAP蛋白的表達量比未使用BDNF的蛋白表達量降低，說明BDNF可以有效降低星形膠質細胞GFAP蛋白的表達，從而說明可以抑制星形膠質細胞的增多，從而降低炎性因子對神經元的損傷，從而起到保護神經元的作用，以上實驗給BDNF的臨床應用提供了實驗依據，若對BDNF的作用機制和作用效果進行更進一步的研究，將會改善由于腦缺血造成的神經系統疾病的治療方法。此研究的應用前景非常廣闊。