Sulfolobus solfataricus P2 β-半乳糖苷酶在枯草芽孢桿菌中的表達及固定化

劉動斌，劉莉娜，吳敬，陳晟*

1(江南大學，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學 生物工程學院,工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 3(江南大學，教育部食品安全國際合作聯合實驗室，江蘇 無錫，214122)

低聚半乳糖(galactooligosaccharides,GOS)是一種低分子量的功能性低聚糖，具有穩定性高的特點，在高溫和酸性條件下也不能夠被分解。此外，GOS具有黏度低，有較強的保濕性，不結合礦物質，口感清爽，熱值較低，甜度僅為蔗糖的20%～40%，且著色性高，水分保持能力強，無不良質構和風味，亦不被人體消化酶所消化，具有良好的雙歧桿菌增殖活性[1]等優點，是一種優質的食品添加劑。目前，GOS已廣泛應用于嬰兒食品、烘焙食品和飲料等行業中[1-3]，其中日本對GOS的開發和利用位居世界前列[4]。在乳制品行業生產低乳糖牛奶和低聚半乳糖過程中，β-半乳糖苷酶起著關鍵作用。

β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)又稱為乳糖酶，廣泛存在于動物、植物、細菌、真菌、霉菌等微生物中，具有水解乳糖的作用，在乳制品行業中用于降低乳制品中乳糖含量，減少乳糖不耐癥的發生。此外，β-半乳糖苷酶兼具轉糖苷的活性，能切割乳糖的β-1,4糖苷鍵，并將游離半乳糖殘基以β-1,3、β-1,4、β-1,6糖苷鍵連接到其它糖分子上，其中以β-1,4糖苷鍵為主[5]，工業上主要依靠糖苷水解酶將半乳糖基從糖基供體轉移到對應的糖苷受體形成糖苷鍵[6]，生產非消化性的功能性低聚半乳糖(GOS)。不同微生物來源的β-半乳糖苷酶合成GOS的能力存在一定差異，如來源于Escherichiacoli、Aspergillusniger的β-半乳糖苷酶的水解活性較強，而來源于Bacilluscirculans、Aspergillusoryzae、Kluyveromyeslactis的β-半乳糖苷酶則有較強的轉苷活性[7-8]?？莶菅挎邨U菌是經我國農業部認定的2種飼料添加菌種之一，也是美國食品藥物管理局(FDA)認定的安全菌種[9]，是一種高效表達的食品安全的宿主菌，有利于食品用酶的工業化生產。來自極端嗜熱古菌硫礦硫化葉菌(SulfolobussolfataricusP2)的β-半乳糖苷酶具有較高的GOS轉化率，且該酶轉化溫度較高，熱穩定性好，酶轉化反應時不易染菌的優良特性，相對于其他常溫β-半乳糖苷酶，更具有工業應用價值。但鑒于該酶是胞內表達，需要經過細胞破碎才能獲取游離酶，獲取酶液的成本較高且回收率較低，此外后期酶轉化反應結束后游離酶與產物分離復雜，這極大地限制了其在工業化中的應用。酶的固定化技術包含固定化酶與固定化細胞，具有良好的儲存和操作穩定性，在儲存較長的時間后，酶活力損失較少[10]，固定化酶與游離酶相比，反應條件得到拓寬，在各種反應條件相同的條件下，固定化酶比游離酶反應轉化效率更高[11]。經反復使用后能夠提高酶的使用效率，并且易于在酶轉化結束后對產物進行分離[12-13]。固定化細胞將游離的細胞固定于一定空間范圍內，具有細胞密度較大，反應速度快、產物的分離簡單、控制方便、細胞損失較少等優點，在工業化生產中廣泛使用[14-15]，其中使用最多的是包埋法固定化細胞。常用的包埋載體有海藻酸鈣、明膠、k-卡拉膠、瓊脂、二醋酸纖維素、三醋酸纖維素、血纖維蛋白、聚丙烯酰胺等[16]。

本研究室在前期工作中獲得1株具有較高轉苷活性的S.solfataricusP2的β-半乳糖苷酶的突變體F441Y[17]，并實現了其在大腸桿菌和畢赤酵母KM71中的重組表達[17-19]。本研究成功地將S.solfataricusP2的β-半乳糖苷酶在枯草芽孢桿菌中進行重組表達，在3 L發酵罐中進行發酵培養。此外，采用細胞固定的方法，將產β-半乳糖苷酶的枯草芽孢桿菌進行細胞固定化，并對其應用于低聚半乳糖的生產進行研究，最高得率為55%。

1 材料和方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株和質粒

菌株BacillussubtilisCCTCC M 2016536，大腸桿菌JM109以及BL21(DE3)/pT7-7-F441Y[17]為本實驗室保藏。表達質粒pT7-7-F441Y，pBSMuL3保藏于本實驗室，其中質粒pT7-7-F441Y含有來源于S.solfataricusP2的β-半乳糖苷酶基因；克隆質粒pMD19-T simple，購于TaKaRa(大連)生物工程有限公司。

1.1.2 主要試劑

鄰硝基苯基-β-葡萄糖苷(oNPG)購于美國的Sigma公司；α-乳糖、海藻酸鈉、戊二醛等其他試劑均為國產AR級。

1.2 培養基

LB培養基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。

TB 培養基(g/L)：蛋白胨12，酵母粉24，甘油4，KH2PO42.31，K2HPO4·3H2O 16.43。

3 L罐培養基(g/L)：大豆蛋白胨20，工業酵母粉15，甘油8，檸檬酸銨1，Na2SO32，(NH4)2SO42.68，K2HPO4·3H2O 14.6，NaH2PO4·2H2O 4.522，MgSO4·7H2O 1；金屬離子液3 mL/L。

補料培養基(g/L)：甘油100，大豆蛋白胨300，MgSO4·7H2O 7.9，金屬離子液40 mL/L。

金屬離子液(g/L)：CaCl20.5,ZnSO4·7H2O 0.18,MnSO4·H2O 0.1,EDTA二鈉 10.05,FeCl38.35,CuSO4·5H2O 0.16,CoCl2·6H2O 0.18。

1.3 培養方法

1.3.1 重組枯草芽孢桿菌β-半乳糖苷酶的構建表達

根據NCBI數據庫中來源于S.solfataricusP2 的β-半乳糖苷酶基因序列設計擴增引物，上游引物：5’-CCAAGCTTAAGGAGGATATTATGTATTCTTTCC CAAATTCT -3’(加粗為HindⅢ酶切位點)；下游引物：5’-CGGGATCCTTAATGACGCAGAGGCTTGA -3’(加粗為BamHⅠ酶切位點)。以質粒pT7-7-F441Y為模板進行PCR，擴增條件為：94 ℃預變性5 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個循環。將擴增出來的基因片段與pMD19-T simple載體連接后轉化至E.coliJM109，涂布到含100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板37 ℃過夜培養，挑選單克隆至LB液體培養基中培養8 h，然后進行質粒提取。質粒經HindⅢ/BamHⅠ雙酶切驗證正確后進行基因測序，將測序正確的質粒記為pMD19-lacS。

將質粒pMD19-lacS與表達載體pBSMuL3分別使用HindⅢ，BamHⅠ雙酶切；膠回收分別得到lacS與pBSMuL3片段，在T4連接酶的作用下16 ℃過夜連接，轉化至E.coliJM109涂布到含100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板37 ℃過夜培養，挑取單克隆至LB液體培養基培養8 h，然后進行質粒提取。將酶切驗證及基因測序正確的重組質粒記為pBSMuL3-lacS，用電轉化法將該質粒轉化至B.subtilisCTCC M 2016536中，構建菌株B.subtilis/pBSMuL3-lacS。構建成功的重組菌于-80 ℃甘油管保藏。

1.3.2 菌株B.subtilis/pBSMuL3-lacS的發酵培養

1.3.2.1 種子培養

將在-80 ℃保存的甘油管活化后，接100 μL菌液于含100 μg/mL卡那霉素的種子培養基中(50 mL培養基/250 mL三角瓶)，37 ℃，200 r/min培養8 h。

1.3.2.2 搖瓶發酵培養

將培養8 h的種子液以5%的接種量接入含100 μg/mL卡那霉素的TB培養基中(50 mL培養基/250 mL三角瓶)；在37 ℃，200 r/min培養2 h后，33 ℃培養至24 h。

1.3.2.3 上罐發酵培養

將培養8 h的種子液以10%的接種量接入含100 μg/mL卡那霉素的發酵罐中；設置發酵參數：溫度33 ℃、pH 7、溶氧30%。其中pH用20%的磷酸與氨水進行調節。第1次溶氧反彈后開啟流加補料培養基。

1.3.3 重組枯草芽胞桿菌發酵分析方法

1.3.3.1 菌體濃度測定

用去離子水將發酵液稀釋到一定的倍數后，置于比色皿中，使用Unic 7200型分光光度計測定其在600 nm處的吸光值，并以等量的去離子水作為空白對照，計算得到菌體生物量(OD600)。

1.3.3.2 檢測方法

用高碘酸氧化法[20]測定發酵液中殘留的甘油。將發酵液用去離子水稀釋一定倍數后取1 mL于比色管中，再加入1 mL 0.015 mol/L高碘酸鈉溶液混勻，室溫10 min后加入2 mL 0.1%L-鼠李糖；混勻后加入4 mL Nash試劑，53 ℃水浴15 min充分顯色，在波長412 nm處測定反應樣品的吸光值，計算發酵液中甘油殘留量。

1.3.3.3 發酵液中氮源殘留量的測定

向比色管中分別加入0.5 mL稀釋后的發酵液，然后加入1.1 mL去離子水，再向其中加入0.4 mL pH 8.04的磷酸鹽緩沖液(用10 mL KH2PO4與190 mL NaH2PO4混合配制)；最后向比色管中加入0.4 mL 20 g/L的茚三酮后混勻，在電爐上沸水浴15 min，取出后冷卻至室溫加水至10 mL。靜置15 min后在波長570 nm處測定吸光值，計算發酵液中殘留的氮源含量。

1.3.4 固定化細胞制備

將一定質量的海藻酸鈉與明膠溶解于去離子水中，混勻形成均一透明的膠體。將發酵液離心后棄上清，用適量生理鹽水將菌體懸浮后加入到前面所配置的混合膠體中，充分混勻后用注射器將其滴加到氯化鈣溶液中(滴加時注意針頭與液面的距離并保持垂直)，形成直徑為2.0 mm左右的微球，后用蒸餾水洗至中性。加入一定濃度的戊二醛溶液，4 ℃放置2 h后用蒸餾水洗去多余的戊二醛，將固定化小球在4 ℃條件下保存備用。

1.3.5 β-半乳糖苷酶酶活力檢測

取適量發酵液離心棄上清收集菌體，用1 mL 0.1 mol/L pH 6.5的磷酸鹽緩沖液將菌體重新懸浮。使用超聲細胞破碎儀將細胞破碎，離心收集上清即為胞內粗酶液。配制20 mmol/LoNPG，取100 μL適當稀釋的酶液、1 800 μL 0.1 mol/L pH 6.5的磷酸鹽緩沖液在80 ℃保溫10 min后，加入100 μL底物，于80 ℃保溫10 min，立即加入1 mL 1 mol/L預冷的Na2CO3終止反應并顯色，用分光光度計在波長420 nm處測定吸光值。酶活力單位定義：在上述分析條件下，每分鐘催化產生1 μmoloNP的酶量為1個活力單位。

固定化細胞酶活力的測定只需要將上述中100 μL適當稀釋的酶液用一定質量的固定化細胞代替，其他步驟相同。固定化酶活收率計算見公式(1)：

(1)

1.3.6 低聚半乳糖的檢測

取一定量pH 6.5，不同濃度的乳糖溶液，置于50 mL具塞錐形瓶中，加入不同量的固定化細胞小球，在溫度80 ℃、轉速150 r/min恒溫水浴搖床中反應不同時間，取樣后在沸水浴中處理10 min，離心取上清。

反應液中，存在不同聚合度的低聚糖。低聚半乳糖中的轉移二糖的檢測條件是：Agilent 1200 HPLC色譜儀，Agilent自動進樣器，色譜柱Thermo Aps-2 HYPERSIL (4.6 mm×250 mm)，示差檢測器Agilent 2410；流動相體積分數為78%乙腈/水溶液，流速和柱溫分別設置為0.8 mL/min和40 ℃。低聚半乳糖中的四糖、三糖以及乳糖和單糖的檢測條件是：Agilent 1200 HPLC色譜儀，Agilent自動進樣器，色譜柱Hi-PlexNa (300 mm×7.7 mm)，示差檢測器Agilent 2410；流動相為純水，流速和柱溫分別為0.3 mL/min和80 ℃。

產物轉化率的計算見公式(2)：

(2)

低聚半乳糖為轉移二糖、轉移三糖和轉移四糖的總和。

1.3.7 固定化酶操作穩定性研究

以pH 6.5的700 g/L的乳糖為底物，1 U/mL 的固定化小球加量，置于80 ℃、150 r/min恒溫水浴搖床中反應10 h后將反應液移出，用pH 6.5的磷酸緩沖液清洗固定化小球至清洗液中檢測不到糖，加入底物進行新一批的反應，連續轉化10批。檢測每批低聚半乳糖生成量，計算各批次產率及固定化小球的殘余酶活，考察固定化酶的重復使用穩定性。

2 結果與分析

2.1 β-半乳糖苷酶基因在枯草芽孢桿菌中的表達

以質粒pT7-7-F441Y為模板，PCR擴增β-半乳糖苷酶全基因lacS，與pBSMuL3片段連接后轉化至E.coliJM109，抽提質粒后用雙酶切驗證。如圖1-a所示，瓊脂糖核酸電泳中目的條帶出現的位置分別與理論值7 987 bp和1 479 bp相符，基因測序結果正確，表明重組質粒pBSMuL3-lacS構建成功。將重組質粒pBSMuL3-lacS轉化至BacillussubtilisCTCC M 2016536中，獲得重組菌B.subtilis/pBSMuL3-lacS。重組菌B.subtilis/pBSMuL3-lacS在TB培養基中搖瓶發酵24 h后，取發酵液進行超聲破壁處理。如圖1-b所示，SDS-PAGE中1號泳道出現的條帶位置與理論值56.6 kDa相符，對照組2號泳道在此處無目的條帶，且破壁上清液中β-半乳糖苷酶酶活力為9 U/mL，這說明β-半乳糖苷酶在枯草芽孢桿菌中表達成功。

圖1 重組枯草芽孢桿菌的構建(a)和重組枯草芽孢桿菌的SDS-PAGE(b)Fig.1 Construction of recombinant Bacillus subtilis(a)and SDS-PAGE (b) of recombinant Bacillus subtilis

2.2 菌株B. subtilis/pBSMuL3-lacS 3L發酵罐分批補料發酵

對菌株B.subtilis/pBSMuL3-lacS進行3 L發酵罐分批補料發酵以探究其產酶水平。前期的發酵研究發現發酵液中碳源與氮源的濃度對菌體產酶有一定的影響，當發酵液中碳源與氮源的濃度過高時，菌體生長過快不利于產酶，當濃度過低時菌體產酶同樣受到抑制，當發酵液中殘留碳源在0.3～0.38 mg/mL，殘留氮源在7～8 mg/mL時產酶最好。如圖2所示通過對發酵液中碳源和氮源殘留量的檢測，控制補料的速度，維持菌體以一定的速率生長，使β-半乳糖苷酶得以高效表達，發酵培養80 h時OD600達到120，胞內酶活達到76.5 U/mL，相對于TB培養基中搖瓶發酵液破壁上清液中β-半乳糖苷酶酶活力為9 U/mL，是搖瓶發酵的8.5倍。

圖2 3 L發酵罐高密度生產LacS發酵過程曲線Fig.2 3 L fermenter high density production LacS fermentation curve

2.3 固定化細胞研究

2.3.1 固定化載體的組分配比

分別以不同濃度的海藻酸鈉對菌株B.subtilis/pBSMuL3-lacS進行細胞的固定化，并探究不同海藻酸鈉濃度下固定化細胞的相對酶活與酶活力回收率。如圖3所示，當海藻酸鈉濃度逐漸增加時，固定化細胞的酶活力和酶活回收率均先升高后降低，在海藻酸鈉質量濃度為20 g/L時固定化細胞的酶活力和酶活力回收率同時達最高點。當海藻酸鈉濃度過低時，固定化載體對細胞的包埋不夠密實，在固定化小球制備和清洗過程中酶活力損失嚴重，酶活力與酶活力回收率均較低；當海藻酸鈉濃度過高時，固定化載體包埋細胞過于緊密且固定化小球難以擠壓制備，酶反應過程中底物與產物的傳質阻力過大，酶活力與酶活力回收率均較低。因此選擇質量濃度為20 g/L的海藻酸鈉為固定化載體。

圖3 海藻酸鈉濃度對固定化細胞的影響Fig.3 Effect of sodium alginate concentration on immobilized cells

該重組β-半乳糖苷酶為高溫酶，其酶反應需要在高溫下進行[17]。以海藻酸鈣為包埋材料不耐高溫，在制備固定化細胞的過程中加入明膠后用戊二醛進行交聯可有效增強其機械強度。因此，在固定化載體中分別加入不同濃度的明膠來探究不同濃度下相對酶活力與酶活力回收率。如圖4所示，在維持固定化細胞顆粒機械強度的基礎上，隨著明膠濃度的升高，其相對酶活與酶活力回收率均先升高后降低，且當明膠質量濃度為10 g/L時相對酶活與酶活力回收率達最高點。當明膠濃度較低時其機械強度不足，酶活有部分損失；當明膠濃度較高時其機械強度過高難以使所包埋的重組細胞發揮其應有的酶活力。綜合以上原因最終選擇在質量濃度為20 g/L海藻酸鈉中加入質量濃度為10 g/L的明膠為固定化載體。

圖4 明膠加量對固定化細胞的影響Fig.4 Effect of gelatin dosage on immobilized cells

2.3.2 交聯劑濃度的分析

戊二醛作為一種功能性交聯劑，能夠與固定化載體中的海藻酸鈉和明膠發生交聯，也能夠使重組菌交聯到載體上，增強固定化顆粒的機械強度以及重組菌的穩定性。分別以不同濃度的戊二醛對固定化細胞進行交聯，以探究其對固定化細胞的相對酶活與酶活力回收率的影響。如圖5所示，當交聯用的戊二醛濃度較低時，沒有足夠的戊二醛與包埋載體進行交聯，引起重組菌的泄露進而導致酶活力降低，而戊二醛濃度較高時能夠有效增強固定化顆粒的機械強度，減少酶活力的損失，且在戊二醛體積分數為0.5%時，獲得最佳的酶活力與酶活回收率。從固定化效果以及節約的角度考慮，最終選擇體積分數為0.5%的戊二醛作為交聯劑的濃度。

圖5 戊二醛加量對固定化細胞的影響Fig.5 glutaraldehyde on the amount of fixed cells

2.3.3 β-半乳糖苷酶加酶量的確定

在前面固定化載體組分優化的基礎上，向100 mL固定化載體中分別加入不同體積發酵液離心后的菌體量(同一批次發酵液，發酵時間24 h，OD600為12)，以探究不同加酶量對酶活力和酶活回收率的影響。如圖6所示，從隨著菌體量的增加，酶活力逐漸上升，但酶力活回收率卻逐漸降低；當加入50 mL發酵液離心所得的菌體量時酶活力與酶活力回收率最優。由于固定化載體單位體積包埋菌體量有限，菌體量過多時容易造成菌體泄露嚴重，酶活回收率降低。因此，考慮固定化載體包埋效率、減少成本，最終選擇每100 mL固定化載體中加入50 mL發酵液離心所得的菌體量。

圖6 菌體加量對固定化細胞的影響Fig.6 The effect of cell addition on immobilized cells

2.4 固定化細胞反應條件對低聚半乳糖轉化率的影響

2.4.1 底物濃度

分別以不同濃度的乳糖為底物進行轉苷反應。如圖7所示，當乳糖質量濃度低于700 g/L時低聚半乳糖產率逐漸增高，當乳糖質量濃度高于700 g/L時，低聚半乳糖產率基本保持穩定，因此，綜合考慮成本與可操作性，選用質量濃度700 g/L的乳糖作為底物。之后的研究底物均為此濃度。

圖7 乳糖質量濃度對GOS產率的影響Fig.7 Effect of lactose concentration on GOS yield

2.4.2 固定化細胞用量

在質量濃度為700 g/L的乳糖中分別加入不同量的固定化細胞進行轉苷反應。如圖8所示，低聚半乳糖的產率隨著固定化細胞加入量的增加先上升后下降。由于該反應是可逆反應當固定化細胞加入量低于1 U/mL時轉苷反應正向進行，GOS產率增加，當固定化細胞加入量大于1 U/mL時，GOS產率達到最大值的時間縮短，反應后期，低聚半乳糖又被水解，轉化率下降[21]。因此選擇1 U/mL固定化細胞加入量進行反應生產低聚半乳糖產率最高。

圖8 固定化細胞加量對GOS產率的影響Fig.8 Effect of the amount of immobilized cells on the yield of GOS

2.4.3 反應時間

以質量濃度700 g/L的乳糖為底物，1 U/mL固定酶加入量進行反應，分別在反應進行不同時間段取樣，以探究反應時間對固定化細胞制備低聚半乳糖的影響。反應體系中低聚半乳糖的產率如圖9所示，在12 h之前隨著反應時間的進行，低聚半乳糖的產率逐漸升高，在12 h時之后，低聚半乳糖的產率緩慢下降。前期由于底物濃度較高反應向正向進行，隨著反應時間的延長生成的低聚半乳糖又被水解，產率下降。綜合考慮選擇12 h的反應時間最宜。

圖9 反應時間對GOS產率的影響Fig.9 Effect of reaction time on the yield of GOS

2.4.4 固定化細胞操作穩定性的研究

固定化細胞以質量濃度700 g/L的乳糖為底物，1 U/mL固定酶加入量反應12 h為一個轉化過程。如圖10所示，隨著轉化次數的增加，低聚半乳糖的產率逐漸下降，連續轉化第6次時的低聚半乳糖產率仍具有41.6%，與轉化第1次時的低聚半乳糖產率55.1%相比，能夠達到第1次低聚半乳糖轉化率的75.5%?？梢钥闯鲈摴潭ɑ妇哂休^好的持續利用性及較高的低聚半乳糖生產能力。

圖10 固化酶的使用穩定性Fig.10 Curing enzyme stability of use

3 結論

本研究成功實現了來源于極端嗜熱古菌硫礦硫化葉菌的β-半乳糖苷酶突變體F441Y在枯草芽孢桿菌中的異源表達，構建菌株B.subtilis/pBSMuL3-lacS。對重組菌B.subtilis/pBSMuL3-lacS在3 L發酵罐中進行了發酵培養，發酵80 h獲得了較好的表達水平，最終酶活達76.5 U/mL。

對重組菌B.subtilis/pBSMuL3-lacS進行細胞固定化條件優化。結果表明，在質量濃度20 g/L的海藻酸鈉、質量濃度10 g/L的明膠，戊二醛交聯體積分數為0.5%，菌體加量為每100 mL固定化載體中加入50 mL發酵液離心菌體條件下，固定化顆粒以及酶活回收率最高，該固定化方法簡單易行，酶活力回收率高。在上述條件下，以質量濃度700 g/L的乳糖為底物，1 U/mL固定酶加入量反應12 h進行酶轉化反應，最終低聚半乳糖的產率達到55.1%。優化后的固定化細胞反應體系連續使用6次后低聚半乳糖的產率依舊有41.6%?？梢钥闯鲈摴潭ɑ毎哂辛己玫牟僮鞣€定性及較高的低聚半乳糖合成能力，為固定化細胞工業化生產低聚半乳糖提供參考。