微生物葡萄糖氧化酶的研究進展

廖兆民，蔡俊，林建國

(湖北工業大學 生物工程與食品學院，發酵工程教育部重點實驗室，工業發酵湖北省協同創新中心，工業微生物湖北省重點實驗室，湖北 武漢，430068)

對葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，E.C.1.1.3.4，GOD)的研究可追溯到1928年MULLER等人從黑曲霉和灰綠青霉的無細胞提取液中分離出一種脫氫酶，將其命名為葡萄糖氧化酶[1]。之后COULTHARD[2]、ROBERTS[3]、KOCHOLATY[4]等人均從青霉菌中分離出一種抗菌劑，僅在葡萄糖作用下才具有殺菌效果，1963年發現這些抗菌劑與MULLER發現的葡萄糖氧化酶是同一類酶[5]。葡萄糖氧化酶的應用十分廣泛，特別是在飼料工業和食品工業上，20世紀末我國成立GOD研究協作組，對其展開了系統的研究，主要集中在產酶菌株的篩選、發酵條件的優化、酶的分離純化及酶學特性等研究，由于國內研究工作起步較晚，目前我國生產的工業酶制劑純度低、成本高且穩定性差，現階段主要利用基因工程技術對產酶菌株進行改良。本文主要綜述產GOD微生物來源，著重介紹了高產GOD工程菌選育的研究進展和微生物GOD的應用，以期為微生物氧化酶的開發和高效利用提供理論依據。

1 葡萄糖氧化酶概述

1.1 葡萄糖氧化酶的理化性質

葡萄糖氧化酶是一種黃素蛋白，是分子質量約為130～170 kDa的同型二聚體，含有兩個黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，FAD)結合位點及約11%～13%的高甘露糖型糖基化部分。GOD屬于葡萄糖/甲醇/膽堿氧化還原酶家族，與家族中其他成員具有相同的結構骨架[6]。高純度的GOD為淡黃色粉末，易溶于水，不溶于甘油、氯仿、乙醚等[7]。GOD的吸收光譜最大值為278、382和452 nm，且在紫外光下無熒光。固體GOD酶制劑在低溫下能長期保存，-15 ℃能保存8年。GOD溶液的穩定性取決其pH值，在pH值2以下及pH值8以上，催化活性迅速喪失，pH值在5.0左右最穩定[8]。GOD的作用溫度為30～60 ℃，最適溫度在55 ℃左右，30 ℃以下及60 ℃以上時，催化活性低于最適酶活的50%。非離子表面活性劑對GOD的影響很小，陰離子表面活性劑如十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)在低pH下使GOD失活，陽離子表面活性劑如十六烷基溴化銨在高pH下使GOD失活[9]。GOD抑制劑包括氯甲基苯甲酸酯，Ag+， Hg2+， Cu2+，羥胺，肼，苯肼，二甲酮和硫酸氫鈉。GOD誘導劑包括葡萄糖、碳酸鈣、巰基乙酸、葡萄酸、乙二胺四乙酸和一些金屬離子如Zn2+、Fe2+、Mn2+、Co2+等[10]。NAKAMURA 和FUJIKI[11]對黑曲霉和青霉的GOD進行了比較研究，發現他們的分子質量分別為152 kDa和150 kDa。這兩種菌株產生的GOD具有相似的碳水化合物成分，均主要由葡萄糖、甘露糖和氨基己糖構成。黑曲霉GOD比青霉GOD含有更多的甘露糖和氨基己糖，但葡萄糖卻相對較少。黑曲霉GOD和青霉GOD中的總碳水化合物含量分別為16%和11%。兩種酶的氨基酸含量表明黑曲霉含有更多的組氨酸、精氨酸和酪氨酸，青霉則含有更多的賴氨酸和苯丙氨酸。

1.2 葡萄糖氧化酶的作用機制

GOD利用分子氧作為電子受體，催化β-D-葡萄糖上的第1個羥基，氧化成D-葡萄糖酸-δ-內酯，同時產生H2O2，兩種產物最終都會自發地催化分解。D-葡萄糖酸-δ-內酯隨后會被內酯酶緩慢水解成D-葡萄糖酸(gluconic acid，GA)，產生的H2O2會被過氧化氫酶(hydrogen peroxide，CAT)分解成O2和H2O。根據乒乓機制，GOD催化葡萄糖氧化的整個反應如下[12]：

GOD(FAD)+β-D-葡萄糖→GOD(FADH2)+D-葡萄糖酸-δ-內酯

GOD(FADH2)+ O2→GOD(FAD)+ H2O2

β-D-葡萄糖+ GOD(FAD)+ O2→GA + GOD(FADH2)+ H2O2

目前已知的氧化酶中GOD因高度特異性而出名，研究發現，GOD作用于D-葡萄糖的β-端基異構體時十分敏感，但底物為α-端基異構體如2-脫氧-D-葡萄糖，D-甘露糖和D-半乳糖時，GOD的催化作用將大大降低[13]。

2 產GOD的微生物來源

GOD可以從許多不同的來源獲得，包括紅藻、柑橘類水果、昆蟲、細菌、植物、動物和真菌。真菌具有使用各種碳源的巨大能力并且能在應力條件下產生GOD，早在1950年真菌GOD就大規模應用于工業[14]，目前生產GOD的最常見微生物是曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)和酵母屬(Saccharomyces)(見表1)。

表1 GOD的微生物來源Table 1 Microbial sources of GOD

2.1 黑曲霉產GOD

在食品工業中，黑曲霉的使用符合美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration，FDA)的安全性指標(generally regarded as safe，GRAS)[15]，大多數商業生產的GOD是從生產葡萄糖酸或葡萄糖酸鹽的黑曲霉菌絲體中分離。未經遺傳改造的天然黑曲霉能產生大量GOD，HAQ等人[16]從旁遮普各地土壤中分離出黑曲霉，GOD產量達到(145.22±0.034) U/mg。CLARKE等人[17]研究了GOD在黑曲霉的細胞外液、細胞壁、細胞質和黏液中的分布情況，其中細胞外液含有38%的酶活，其余62%與菌絲體有關，分別以34%、12%、16%的比例分布在細胞壁、細胞質和粘液之間。BANKAR等人[18]研究了影響黑曲霉產GOD的最佳營養因子，蔗糖、蛋白胨、NaNO3和CaCO3作為培養成分時，酶活顯著增加了28.93倍，其中CaCO3作為一種強誘導劑誘導GOD的產生。DIEGO等人[19]發現葡萄糖氧化酶產生在指數生長期。多變量實驗表明，pH值和攪拌參數對GOD的產率影響最大，產酶最佳碳源是葡萄糖而不是蔗糖，這一點與BANKAR等人報道的有所差異。HATZINIKOLAOU和MACRIS曾報道過葡萄糖(純的或作為蔗糖水解轉化酶的產物)是GOD基因轉錄的主要誘導劑，但某些情況下蔗糖卻是最佳碳源，關于最佳碳源的選擇還有待進一步的研究。EL-HARIRI等人[20]用兩種改良的基礎液體培養基篩選了產GOD黑曲霉，在沃格爾肉湯培養基上顯示產GOD陰性，但在察氏培養基上GOD酶活達7.28 U/mL，GOD的產生可能受3種可控因素的影響：基礎培養基成分、培養時間和菌株對培養基成分的適應性。其中，在接種黑曲霉9 d后GOD產量最高，這與BANKAR和PETRUCCIOLI等人[21]報道的接種后第3天達到最大酶活不一致。雖然黑曲霉是目前商業應用最廣泛的產GOD菌株，但由于大部分酶活存在于細胞內，常用的超聲破壁法和酶解法操作繁瑣且破壁效率低，一種高破壁率且簡便的GOD分離方法還有待深入研究。

2.2 青霉屬產GOD

目前在生物傳感器和生物燃料領域，GOD的應用十分廣泛。黑曲霉和青霉的總碳水化合物含量分別為16%和11%，黑曲霉GOD的糖基化程度高于青霉GOD，較高的糖基化程度限制了傳感器中電子從電極遷移到GOD的速率，從而降低了生物傳感器的靈敏度。 KALISZ等人[22]研究了青霉菌中去糖基化GOD的酶學特性，發現去糖基化不影響GOD最適溫度和最適pH值的動力學，也不增加GOD對蛋白質降解的敏感性，但表現出酶的pH值穩定性和溫度穩定性的降低。通過與黑曲霉GOD對比，發現青霉GOD具有更好的底物親和力和催化效率，應用在生物傳感器上具有更好的優勢。KIESS等人[23]通過埃德曼降解和質譜分析確定了來自青霉菌的GOD完整氨基酸序列，每個單體的完整序列包含587個氨基酸殘基，含有3個半胱氨基酸殘基和7個潛在的N-糖基化位點，研究表明青霉GOD和黑曲霉GOD具有高度的同一性(66%)和相似性(79%)。KONISHI等人[24]報告了黃青霉的葡萄糖氧化酶制劑的安全性。對大鼠進行了90天重復劑量口服毒性研究，在高達15 600 U/(kg·d)的黃青霉GOD劑量下(相當于193 mg總有機固體/(kg·d))，大鼠體內沒有發現相關的化合物副作用。另外，黃青霉GOD在一系列遺傳毒性測試中顯示出非遺傳毒性，具體測試包括細菌回復突變試驗、體外哺乳動物染色體畸變試驗、體內哺乳動物紅細胞微核試驗和彗星試驗，研究表明黃青霉GOD同樣可用于食品行業，并且具有十分可靠的安全性。

盡管天然GOD在各個方面表現出它的巨大潛力，但在工業化生產上卻存在明顯的缺陷。一方面，大部分天然GOD來源于霉菌，霉菌在發酵過程中形成的菌絲體會使發酵液的黏度增高，從而影響攪拌和供氧的速度，菌絲體的存在也導致發酵液中營養成分的不均勻混合，最終導致產品的回收率低。另一方面，天然GOD的分子結構復雜，導致酶的穩定性差。在食品加工、飼料生產、紡織漂白等方面，酶的耐熱性、耐酸性及耐氧化性遠遠達不到工業化生產的要求。因此，目前工業生產GOD的微生物均優選于經過基因工程改造的酵母菌屬。

3 高產GOD工程菌的選育

天然GOD的大規模生產受發酵能力低、純化工藝復雜，酶活性低等因素制約，且傳統過程中往往伴隨其他雜質的產生，包括CAT、纖維素酶和淀粉酶，同時GOD可以被H2O2滅活，因此構建工程菌生產GOD成為主要研究方向。過去十幾年，利用漢氏酵母和釀酒酵母異源表達GOD進行工業化生產被認為具有很大的前景[25]，但是重組酶的高糖基化限制了其在生物傳感器上的使用[22]。有研究人員在大腸桿菌中表達出非糖基化的GOD，但是重組酶以不溶性包涵體的方式存在，僅僅40%左右的蛋白質存在活性[26]。畢赤酵母作為僅次于大腸桿菌的第二大表達系統，具有進行許多真核轉錄翻譯修飾的能力，如信號序列的處理、糖基化及二硫鍵形成等，可作為GOD表達的良好表達系統。CROGNALE等人[27]在畢赤酵母X33中表達了可變青霉P16的GOD基因，3 L發酵罐中未優化發酵15 d，其酶活達到50 U/mL。重組酶比天然酶的糖基化程度略高，分別是17%、14%，酶學特性相似。GUO等[28]在蛋白酶缺陷性畢赤酵母中表達了黑曲霉Z-25GOD，搖瓶優化后酶活達到400 U/mL，觀察到重組酶的Km和Kcat值比天然酶的略低，盡管較低的Km值有助于提高酶對β-D-葡萄糖的親和力，但較低的Kcat值則代表了重組酶較慢的催化速度。郜趙偉等人[29]通過密碼子優化實現重組GOD的高水平表達，突變了涉及228個殘基的272個核苷酸并調整了G+C含量，高密度發酵后酶活達到615 U/mL，使GOD的產率提高到原來的410%，實現面包焙烤工業的低成本替代。顧磊等人[30]對比了黑曲霉GOD和青霉GOD的基因序列，對其酶活性保守區域內的差異氨基酸位點進行突變，復合突變體的Kcat/KmA提高至rGOD的2.4倍，將CAT中區域B和D分別與GOD的N端與C端融合，突變體的溫度穩定性和耐氧化性均有所增強，然后證實了共表達HAC1基因對于蛋白折疊機制的正向作用，研究了各模塊基因改造對GOD產量的影響并進行組合優化，GOD酶活達到1 972.9 U/mL。近幾年來，葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶的交聯結合酶聚體廣泛用于食品和制藥工業的各個領域，用于催化級聯反應[31-32]。但GOD的利用通常受限于極端溫度、pH值或表面活性劑存在的高溫條件，高穩定性的GOD將大大提高其利用價值。牟慶璇等人[33]通過整合分子伴侶二硫鍵異構酶和透明顫菌的血紅蛋白使酶活提高了150%，利用計算機軟件輔助突變了S16K、Q243H和H477Y三個氨基酸位點使熱穩定性達到63 ℃。JIANG等人[10]通過設計突變體，用計算機CDOCKER算法輔助進行同源性建模，將亮氨酸替換成甲硫氨酸，從而提高了GOD對H2O2(競爭性抑制劑)的抗氧化能力。 獲得的結果與計算機輔助分析的結果一致，表明這種方法對酶結構優化的有效性。ROUPAIN等人[34]采用隨機突變和理性設計的方法分離出無特征突變的黑曲霉葡萄糖氧化酶，改進了其性質，發現兩種突變能顯著提高酶的熱穩定性。其中突變體T554M引入一個硫-π作用，突變體Q90R/Y509E在二聚體蛋白結構界面附近引入一個新的鹽橋。另一種雙取代突變體Q124R/L569E的穩定性沒有顯著提高，但酶的比活性增加兩倍，結果顯示了蛋白質結構對酶整體穩定性的影響。

GOD在工業上的適用性依賴于它的高催化活性、底物親和力以及高穩定性。來源真菌的GOD具有廣譜應用的特點，為了產生更高的經濟效益，它必須在更極端的溫度和更長的時間內保持穩定，如在面包焙烤的高溫條件下、食品和藥品低溫生產條件下及在傳感器中長期使用條件下均能保持良好的穩定性。GOD的優化可以利用現代分子技術與生物工藝工程技術相結合，實現經濟可行的酶生產系統，將高效重組微生物技術和蛋白質工程技術相結合，提高GOD穩定性的同時可以進一步提升其工業價值。盡管已經有許多成功的研究通過使用遺傳修飾和其他方法來改善和優化真菌GOD的產生，但是不同真菌積累GOD的機制尚沒有權威的報道，這一點仍然是目前研究的突破口。

表2 GOD基因工程菌株Table 2 Genetically engineered strain of glucose oxidase

注：表中“—”表示文獻中未提到

4 微生物GOD的應用

4.1 食品領域的應用

在烘焙行業中，GOD作為一種高效的氧化劑，可以提高面包的質量，增大面包的體積，由GOD產生的H2O2能提高面團的彈性和黏性[35]，但GOD添加過量會引起不良的反應[36]。研究發現,GOD和其他添加劑共加入會產生協同作用，如GOD和脂肪酶共同添加可以提高面包的質量和保質期；在小麥粉中添加基礎添加劑及32%抗壞血酸、4.2%α-淀粉酶和63.8%GOD能降低面包的硬度和咀嚼性并改善其粘彈性和體積[37]。AITLNEL等人[38]發現了淀粉葡萄苷酶、GOD和半纖維素酶的組合利用對面團流變學特性的協同效應。APRODU和BANU等人研究了車前子、豌豆纖維、燕麥麩皮、水和GOD對無谷蛋白玉米面包的流變學性質和烘烤性能的影響，表明GOD能顯著的改善所有纖維類型的面包體積[39]。

在飲料制造中，GOD通過消除殘留的葡萄糖從而減少葡萄酒中的低度酒精物質[40]，目前通過將GOD固定在尼龍纖維膜上研發出一種新型葡萄糖電化學傳感器，能夠分析商業飲料中葡萄糖含量和監測啤酒的釀造過程[41]。

GOD還有一個主要的應用是生產GA及其衍生鹽，GA可通過生物化學、電化學、生物電化學和微生物發酵過程來生產，但發酵法是GA生產的首選方法，其他方法價格昂貴且生產效率低[42]。葡萄糖轉化為GA的催化效率高度依賴于GOD的穩定性，最近，已經證明在無機載體SiO2體系上修飾過的葡萄糖與酶交聯的穩定系統使GA產率達到目前最高85%[43]。GA在面包、飼料和飲料等領域被用作色素穩定劑、酸化劑、抗氧化劑和螯合劑等。在乳品工業中，GA用于促進乳酪凝乳的形成、提高牛奶的熱穩定性、鋁罐的清洗及防止奶石的形成[43]。GA衍生鹽如葡萄糖鈉具有螯合金屬離子的巨大潛力，并且可用于去除食品中的苦味[44]。

GOD還可用作食品抗菌劑，對不同的食源性病原體具有抗菌活性，包括產氣莢膜梭菌、沙門氏菌、李斯特菌、金黃色葡萄球菌、空腸彎曲桿菌、大腸桿菌和蠟狀芽孢桿菌等[45]。GOD及其產物H2O2和GA對幼蟲芽孢桿菌ATCC9545具有體外抗菌活性，已應用于食用抗菌薄膜，通過在食品表面釋放足夠數量的抗菌物質來提高食品的保質期[46]。

4.2 醫藥行業的應用

葡萄糖生物傳感器用于快速、準確監測糖尿病患者血糖濃度，目前已經開發出了更先進的技術如連續葡萄糖監測儀[47]，葡萄糖生物傳感器的缺點和局限性可通過電極、膜、酶固定化和納米復合膜修飾電極等先進方法消除。GOD的固定化能加快催化反應速率、增強GOD的穩定性、提高生產率以及降低操作成本，是研制高穩定、具有長期使用壽命葡萄糖生物傳感器的關鍵因素。將GOD結合到生物傳感器的方法包括吸收、共價吸附、交聯和微囊化，HONG[48]等人通過酶吸附、沉淀、交聯組合混合制備方法，開發了基于GOD固定在氧化石墨烯上的生物傳感器，以交聯沉淀形式存在的GOD聚集體提高了酶的裝載量和系統的穩定性。

4.3 其他領域的應用

在紡織工業中，GOD產生的H2O2是一種有效的工業漂白劑，是應用最廣泛的商業H2O2替代品。ABER等人[49]利用生物芬頓法通過GOD產生的對染料溶液進行脫色，他們將GOD固定在磁體礦納米粒子Fe3O4上并研究了最佳脫色條件，該系統可有效地用于葡萄糖的氧化和原位生成H2O2去除酸性黃12。FAROOQ等人[50]對比了傳統漂白和GOD催化漂白對針織棉織物的漂白效果，發現酶漂白劑能提高織物的白度和力學性能,如抗拉強度和撕裂強度。近幾年，研究發現以酶為生物催化劑的生物燃料電池系統是未來可植入設備的優良替代品[51]，人們開發了可植入微型化膜/無室裝置,如人造胰腺和起搏器中的胰島素泵和葡萄糖傳感器。CHRISTWARDANA等人[52]將GOD-CAT共固定化增強了無膜生物燃料電池的發電效率，該系統存在協同作用機制,如CAT分解了不利于電池發電的H2O2同時激活了GOD的氧化反應。GOD還大量用于飼料工業，據研究，日糧中添加GOD可以增強仔豬的生長能力、提高體內生長發育相關激素水平和改善仔豬的糞便微生物群落[53]，每噸日糧中添加100 g GOD可以有效改善仔豬腸道健康和血清中相關生長激素含量[54]。

5 結語

GOD在食品、飼料、醫藥、紡織和新能源等領域的應用十分廣泛，特別是在食品和飼料工程領域，我國作為農業大國,GOD的產量及穩定性遠遠達不到市場要求。我國對GOD的研究起步較晚，目前國內的研究主要在于高產GOD菌株的選育和酶學特性研究。盡管有多種微生物能產生GOD，但實際應用于商業的微生物種類僅占小部分，開發新的GOD來源和具有成本效益的發酵工藝應被高度重視。近年來，酶固定化技術被開發為大規模生產GOD的新方法。然而，酶固定化后的擴散限制和酶活性下降等問題限制了固定化GOD的應用，該方面的研究還需深入突破。利用現代生物技術如蛋白質設計、定點誘變等可實現GOD在各領域的大規模高效利用，將GOD在具有潛力的微生物中重組表達確實大大提高了GOD的產量，但GOD穩定性的提高有待于進一步研究以滿足未來的市場需求。