饅頭質構性狀與單核苷酸多態性標記關聯分析

劉娟，陳廣鳳，田紀春，吳澎*，趙子彤，楊藝，李向陽，唐曉珍

1(山東農業大學 食品學院，山東省高校食品加工技術與質量控制重點實驗室，山東 泰安，271018) 2(德州學院 生態與景觀學院，山東 德州，253023) 3(山東農業大學，小麥品質育種研究室，山東省作物生物學重點實驗室，山東 泰安，271018)

饅頭作為我國北方人民的主食，在膳食結構中一直占有重要的地位。饅頭的質構性狀也一直被作為評價饅頭感官質量的好壞重要指標，良好的質構性狀不僅會提升饅頭的感官質量，同時，也會增加其經濟價值。因此，改良饅頭的質構性狀對饅頭的生產和銷售具有重要的意義。目前，已有許多有關饅頭質構性狀的研究[1-7]。但這類研究大多聚焦于小麥粉碎顆粒度、添加膳食纖維或者酵母等影響饅頭質構的外部因素，未能深入探究影響饅頭質構的內部因素即原料小麥基因位點的多態性。

近幾年，利用全基因組關聯分析(genome-wide association study, GWAS)進行目標性狀與遺傳基因標記或候選基因的關聯研究成為熱點。GWAS是通過利用表型性狀和基因自身或臨近基因較小區域的分子標記的關聯來實現基因的精確定位[8-10]。單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)標記作為新型的第三代分子標記，與傳統分子標記相比SNP具有數量多、分布廣和密度高的特點，能在待測基因的附近和內部提供一系列標記[11-12]。目前已應用于遺傳圖譜的構建[13]、分子標記輔助育種[14-16]以及遺傳和物種進化分析[17-18]，但基于SNP標記的小麥類產品如饅頭、面條等的全基因組關聯分析的研究未有報道。

本研究以205份不同品種的冬小麥為實驗材料，利用分布于小麥全基因組的24 355個SNP標記進行性狀與標記間的關聯分析，以實現饅頭質構性狀的精細基因定位，為從分子角度全面深入研究饅頭的各品質性狀奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與表型鑒定

實驗材料為205份來自于中國10個種植冬小麥的省份及墨西哥與法國的小麥品種，其中203份來自于中國，2份分別來自于墨西哥與法國(表1)。供試材料中有132份品種為骨干親本，73份為高代品系。

在2014和2015年度，分別將205份不同小麥品種種植于山東德州(德州市農業科學院)與山東泰安(山東農業大學)，種植條件為：每份材料播種3行，行長2 m，行間距0.25 m，每行播種70粒，重復兩次。小麥生長期間，進行常規田間管理，沒有出現嚴重的病蟲害現象。

表1 供試小麥材料Table 1 Wheat varieties used in this study

小麥成熟后，進行收割，并研磨成面粉，將面粉按照最初來源進行編號后參照周素梅等[19]的實驗室饅頭制作方法并略做改進。待饅頭冷卻后，平放于桌面上，用切割機將饅頭沿豎直方向平行切割成3片，取中間片于質構儀上，在TPA模式下采用P35探頭進行壓縮實驗[20]，測試前速度3.00 mm/s，測試和測試后速度1.0 mm/s，壓縮距離50%。第一次壓縮結束后，探頭回到起始位置，等待3s后進行第二次壓縮。并采用SPSS 18.0軟件統計分析所得數據。

1.2 DNA提取和90K SNP芯片分型

根據稍作改動的Triticarte (http://www.triticarte.com.au)方法從不同品種小麥幼葉組織中提取DNA，用0.8%濃度瓊脂糖電泳對DNA的濃度和質量進行測定。委托加利弗尼亞大學生物技術檢測中心，使用最新開發的包含81 587個SNP位點的小麥90K基因芯片對DNA數據進行分型，并用GenomeStudio軟件讀取分型結果并保存。為確保分型數據結果的質量，用PLINK v1.07[21]進行檢測，選取低基因頻率大于5%和檢出率大于80%的SNP標記用于饅頭色澤性狀關聯分析[22]，最終得到24 355個SNP位點。

利用WANG等[23]整合的遺傳位點信息，對本研究獲得的基因位點進行整合，得到實驗群體SNP復合遺傳圖譜信息(表2)。

表2 SNP復合遺傳圖譜信息Table 2 Information of SNP in the integrated linkage map

1.3 性狀和標記的關聯分析

分別運用3種模型GLM、GLM_Q、MLM_Q+K對E3環境中的饅頭膠著感性狀進行關聯分析研究，旨在選出適合關聯分析的最優統計模型。在此基礎上利用TASSEL 3.0 軟件對目標性狀進行關聯分析，當標記的p<0.001時表明該標記與性狀有顯著關聯，p<0.000 1時說明兩者存在極顯著關聯，當標記在兩個及以上環境中同時被檢測到則認為其是目標性狀相對穩定的關聯位點。

2 結果與分析

2.1 饅頭內外質構表型變異分析

4個環境中饅頭質構相關性狀的表型數據如表3所示，7個色澤相關性狀均表現出較大的變異系數。其中，E1環境黏著性變異系數最大(58.50%)；彈性變異系數最小(3.21%)。除此之外，7個性狀的峰度和偏度的絕對值大部分都小于1，符合正態分布，屬于數量性狀遺傳，適合進行關聯分析。

表3 四個環境下饅頭質構在群體中的表型數據Table 3 Phenotypic data of texture traits of steamed bread in four different environment

注：E1：2014年泰安點；E2：2014年德州點；E3：2015年泰安點；E4：2015年德州點。

2.2 關聯分析最優統計模型的選擇

運用3種模型對E3環境中饅頭饅頭膠著性進行關聯分析，得到Manhattan圖和Q-Q plot圖如圖1所示。圖1-a為GLM模型，Manhattan圖表明該模型獲得大量與相關性狀顯著關聯的SNP位點，Q-Q plot圖則顯示顯著位點的P值明顯偏離預期P值，群體存在分層的現象，表明GLM模型對群體結構校正作用較差，不能很好的控制關聯分析結果的假陽性。圖1-b為GLM_Q模型，因該模型控制了群體結構Q，使得與GLM模型相比，Manhattan圖檢測到的顯著關聯SNP位點數減少，Q-Q plot圖同樣表明顯著位點的P值明顯偏離預期P值。當采用MLM_Q+K模型時，由于其同時對親緣關系和群體結構進行控制，Manhattan圖獲得的顯著位點明顯減少，說明該模型可較大程度的減少假陽性位點，其Q-Q plot圖顯示的實際P值與預期P值吻合，表明可較好地校正群體結構，因此，MLM_Q+K模型的關聯分析結果是準確可靠的，本實驗選擇MLM_Q+K模型對饅頭質構進行全基因關聯分析。

a-GLM模型; b-GLM_Q模型; c-MLM_Q+K模型圖1 E3環境3種模型饅頭膠著感全基因組關聯分析的Manhattan圖和Q-Q plot 圖Fig.1 Manhattan plot and Q-Q plot of GWAS for close feeling using three Modes in two environments注：紅色水平線代表全基因組關聯分析的顯著閾值(p<0.001)。

2.3 SNP標記與饅頭質構相關性狀的關聯分析

通過全基因組關聯分析，4個環境共檢測到313個與饅頭質構性狀存在顯著關聯(p<0.001)的位點，其中，31個極顯著(p<0.000 1)關聯位點，單個關聯位點的遺傳變異貢獻率為8.93%～25.14%，11個相對穩定關聯位點，46個高遺傳貢獻率位點(R2>10%)，分布在小麥21條染色體中的15條(表4)。

表4 四個環境中與饅頭質構相關性狀極顯著 (p<0.000 1)、高貢獻率和穩定位點Table 4 Highly significant (p<0.000 1) , or high genetic contribution and stable association MTAs for texturetraits of steamed bread in four environments

續表4

性狀標記染色體位置R2/%p值環境GENE-2794_5345B11011.362.98E-05E3BS00084907_515B14410.267.00E-05E3BS00067911_517A23211.604.19E-05E4wsnp_JD_c13673_136060667B13610.512.69E-05E4BS00023069_517B17110.423.57E-04E2咀嚼性Excalibur_c4948_907B14514.614.12E-05E2Tdurum_contig61884_8367B14813.38,10.414.35E-05,2.52E-05E1,E2IAAV88367B14413.244.75E-05E2BS00041585_512B709.701.03E-05E1黏聚性BS00065168_511A1710.939.99E-04E2Kukri_c13329_8002D3713.80,12.755.99E-06,5.35E-06E1,E4Tdurum_contig5009_3493A18210.364.87E-04E2RFL_Contig3008_13703B910.745.68E-04E3Tdurum_contig45817_1933B1069.649.72E-05E1BS00067744_515B1018.93,7.832.37E-05,4.79E-04E3,E4RAC875_c27696_7187A13611.851.50E-05E2Tdurum_contig56175_7917A1369.357.07E-05E2硬度BS00041585_512B7010.515.82E-05E1IAAV42062B7010.266.28E-05E1RAC875_c12766_4612B7010.266.28E-05E1IAAV22772B7010.176.79E-05E1BobWhite_c8436_3914A1538.62,7.493.21E-04,6.85E-04E1,E4Tdurum_contig61884_8367B14813.494.59E-05E2Excalibur_c4948_907B14513.031.00E-04E2IAAV88367B14411.971.16E-04E2BS00066342_517B1559.43,7.317.65E-05,8.64E-04E2,E3彈性wsnp_Ex_c10595_172919991A7110.426.13E-05E3Ex_c21450_3961A719.869.46E-05E3Ra_c69908_18771A719.829.72E-05E3Ex_c3201_10461A14010.493.39E-04E2wsnp_Ex_c59373_602608762A8310.024.54E-04E2IAAV15352B14513.665.06E-05E2Tdurum_contig10048_612B14610.074.44E-04E2Tdurum_contig52627_7262B14610.074.44E-04E2BobWhite_c12911_7882B14710.074.44E-04E2wsnp_CAP11_c3226_15880702B14710.074.44E-04E2Excalibur_c4964_2755A3910.134.31E-04E2BS00099401_516A14110.473.44E-04E2GENE-4717_7967D19310.034.56E-04E2回復性Kukri_c13329_8002D3713.109.39E-06E1RAC875_c5427_4473B9210.583.58E-04E2RAC875_c27696_7187A1369.32,7.637.11-04,5.87E-04E2,E4膠著性Ex_c5445_9815A166.19,5.494.92E-04,9.49E-04E1,E2BS00000020_515D10315.01,11.782.62E-11,4.44E-10E1,E2

注：E1：2014年泰安點；E2:2014年德州點；E3:2015年泰安點；E4:2015年德州點。

檢測到與黏著性極顯著(p<0.000 1)相關的位點12個，分布于1B、2A、2B、2D、3A、3B、5B、7A、7B染色體上，單個關聯位點的表型變異貢獻率為10.12%～25.14%；位于2A染色體上的位點Kukri_c79633_88、3B染色體上的wsnp_Ex_c40060_47197713和5B染色體上的Tdurum_contig23273_315在兩個環境中被同時檢測到，為相對穩定關聯位點；3B染色體上的RFL_Contig5418_347的表型變異貢獻率最大(25.14%)，但只在E3環境中被檢測到。

檢測到4個與咀嚼性極顯著關聯的位點，分布在2B和7B兩條染色體上，單個關聯位點的表型變異貢獻率為9.70%～14.61%；位于7B染色體上極顯著位點Tdurum_contig61884_836在兩個環境中表達，且貢獻率(R2)大于10%，為主效關聯位點。

與黏聚性極顯著關聯的位點為4個，分布在2B、3D、7A染色體上，單個關聯位點的表型變異貢獻率為8.93%～13.80%；2D染色體上的位點Kukri_c13329_800與5B染色體上的BS00067744_51在兩個環境中同時被檢測到，并且極顯著關聯位點Kukri_c13329_800，貢獻率大于10%，為主效關聯位點。

與硬度極顯著關聯的位點為5個，分布在1A、2A、2B、5A、6A、7D染色體上，單個關聯位點的表型變異貢獻率為10.17%～13.49%；4A染色體上的位點BobWhite_c8436_391與7B染色體上的BS00066342_51在兩個環境中表達，為相對穩定位點。

檢測到4個與彈性極顯著關聯的位點，分布在2B和7B兩條染色體上，單個關聯位點的表型變異貢獻率為9.82%～13.66%；3B染色體上的IAAV1535的表型變異貢獻率最大(13.66%)，但只在E2環境中被檢測到。

檢測到與回復性和膠著性極顯著關聯的位點較少，分別為1個，7A染色體上與回復性相關聯的位點RAC875_C27696_718在兩個環境中表達，為相對穩定位點，同為相對穩定位點的還有與膠著性關聯的5A染色體上的位點Ex_c5445_981和5D染色體上的位點BS00000020_51，后者的貢獻率大于10%，為主效關聯位點。

2.4 饅頭質構多效性關聯位點

在與饅頭質構性狀顯著關聯的位點中(p<0.001)，同時與2個及2個以上性狀存在關聯的位點被稱為多效性關聯位點(表5)。本實驗共檢測到23個與饅頭質構性狀存在顯著關聯的多效性位點，其中染色體2D上位點Kukri_c13329_800與染色體7A上的位點wsnpcEx_c14654_22713386同時關聯性狀最多(4個)，其次為2B染色體上Tdurum_contig14707_251、4B染色體上Tdurum_contig4974_355和7D染色體上D_contig06359contig118(3個)，1A染色體上BS00056823_51和2A染色體上wsnpcEx_c19556_28530231等18個位點關聯性狀最少(2個)。

3 討論

全基因組關聯分析(GWAS)是將自然群體作為研究的對象，基于該群體長期的基因重組所導致的連鎖不平衡現象，利用分布于全基因組的SNP來實現目標性狀的多樣性與基因位點的關聯分析，從而可檢測出與目標性狀多樣性有密切關聯的基因位點或SNP。目前，GWAS已廣泛應用于玉米[24]、水稻[25]等農作物的農藝性狀相關位點的挖掘中，由于小麥全基因組的精密圖譜一直在完善之中，因此整合構建遺傳圖譜可為GWAS的進行提供精細的SNP遺傳位點信息，具有重要的意義。COLASUONNO等[26]利用硬粒小麥的重組自交系構建了包含467個DArT、5 019個SNP、182個SSR標記的遺傳連鎖圖譜，并定位了7個與色黃素含量有關的QTL；RAZ等[27]利用90K基因芯片技術對硬粒小麥和野生二粒小麥雜交構建的140株小麥群體進行全基因組掃描，共發現14 088個SNPs位點，14個連鎖群，構建了全長為2 110 cm的遺傳圖譜。本研究利用6個已知群體的SNP標記信息，整合了自然群體的24 355個SNP標記的復合遺傳圖譜，為饅頭質構相關性狀關聯位點提供遺傳信息，具有重要價值。

本研究利用24 355個SNP位點以及MLM_Q+K模型對饅頭質構性狀進行關聯分析，在顯著水平下檢測到較多的關聯位點。一方面說明了檢測位點較為全面，另一方面也表明了該試驗群體的遺傳變異較為豐富。此外，環境因素對作物基因的表達有重要的影響，關聯位點的表達可分為兩類，一類為環境間特異性表達，另一類為多種環境下穩定表達。本實驗設置了4個不同環境E1、E2、E3、E4，并將在兩個及以上環境中表達的關聯位點定義為相對穩定的關聯位點。通常，關聯分析結果中顯著性較大的位點與性狀的關聯度較高，假陽性的概率低，因此，本實驗將顯著性較大的位點(p<0.000 1)定義為極顯著關聯位點。相對穩定關聯位點與極顯著關聯位點都對研究饅頭質構性狀有較大的意義，可有效地發掘饅頭質構性狀相關基因。

4 結論

利用24 355個SNP標記對205種小麥粉饅頭的質構性狀進行全基因組關聯分析，結果檢測到31個與質構性狀極顯著關聯的位點，單個關聯位點的遺傳變異貢獻率為8.93%～25.14%，11個相對穩定關聯位點，5個主效關聯位點，分布在小麥21條染色體中的15條。其中，主效關聯位點Kukri_c13329_800同時與4個性狀存在關聯。這些標記的獲得可用于小麥標記輔助育種的選擇，以及為從基因方面對饅頭各品質進行全面研究做鋪墊。