α-L-鼠李糖苷酶高密度發酵及其固定化

劉嘉男,鞏建業,高庭,李利君,倪輝

(集美大學 食品與生物工程學院，福建 廈門，361021)

異槲皮苷是一種含有多個酚羥基的黃酮醇苷類化合物，具有消除炎癥[1]、抗氧化活性[2]、降血糖[3]、降血壓[4]、抗過敏[5]等藥理作用。異槲皮苷的天然含量很少，往往通過水解蘆丁來制備。常用的方法有強酸水解蘆丁、有機溶劑提取、高壓水解蘆丁和酶水解蘆丁等[6-8]。其中強酸和有機溶劑提取法對環境的污染嚴重，高壓水解法對生產設備耐高溫高壓要求高、耗能較大，而利用酶水解蘆丁操作工藝相對簡單，反應條件溫和且污染較少，具有重要研究應用價值。

α-L-鼠李糖苷酶(EC3.2.1.40)可用于制備異槲皮苷，通過水解蘆丁上的1,6-α-鼠李糖苷鍵，生成異槲皮苷。吳迪[9]等人研究表明，運用蘆丁-L-鼠李糖苷酶轉化蘆丁生產異槲皮苷，生產反應的條件溫和、易于控制，是制備異槲皮苷的理想方法，因此研究相關酶的發酵生產具有重要意義。張雪銘[10]等人研究了黑曲霉α-L-鼠李糖苷酶高密度發酵條件，取得了一定成果。但黑曲霉發酵后需要通過純化去除自身產生的其他多種蛋白，同時黑曲霉常見的固態發酵會產生菌絲體，為純化帶來不便[11]。畢赤酵母表達系統具有表達效率高，自身分泌蛋白少[12-13]，胞外表達的目的蛋白易于純化等特點[14]；此外，畢赤酵母成熟的發酵工藝適用于高密度發酵，可滿足α-L-鼠李糖苷酶的工業實際應用。研究發酵過程中甲醇的添加量是保證畢赤酵母不受甲醇毒害作用，保持正常分泌外源蛋白的重要因素[15]。α-L-鼠李糖苷酶的固定化能簡化酶在反應體系中的分離工藝，提高酶的穩定性和重復利用率，節約成本同時簡化催化工藝，提高生產效率[16]。因此，本研究通過優化甲醇的添加量提高了α-L-鼠李糖苷酶高密度發酵產量，并對該酶的固定化特性進行了研究，為工業化生產α-L-鼠李糖苷酶和酶法轉化蘆丁生產異槲皮苷提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

重組畢赤酵母GS115/pPIC9k-rha菌株，由集美大學食品與生物工程學院發酵工程實驗室保藏。蘆丁(≥98%)購于西安小草植物科技有限責任公司；甲醇(GR)、乙腈(GR)購于美國西格瑪奧德里奇有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

BLBIO-5SJ 發酵罐，上海百侖生物科技有限公司；DGU/SPD/SIL-20A高效液相色譜儀，日本島津儀器制造有限公司；ALP全自動滅菌鍋，上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；ZD-9550脫色搖床，海門其林貝爾儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 α-L-鼠李糖苷酶5 L發酵罐發酵培養

以3.325 g無氨基酵母氮源、3.725 mL甘油、0.1 mg生物素和250 mL無菌水配置成種子培養基接入1 mL重組畢赤酵母GS115/pPIC9k-rha菌株，于30 ℃、200 r/min的搖床中培養至有白色結晶出現，然后以5%的接種量接種到2.5 L的發酵培養基中，以體積分數為25%的NH4OH調節pH至5.0～6.0，在30 ℃及溶解氧高于40%的條件下發酵培養。

待培養基中的甘油耗盡后，進行流加甘油培養，初始流加速率為10 mL/(L·h)，經過10 h后，將流速提升到500 mL/(L·h)，培養酵母直至所需密度。發酵過程中每隔8 h取1次樣測濕重及酶活。

甘油流加培養至所需密度后，停止補加甘油，將溶解氧調節至60%左右維持30 min，隨后將發酵溫度調節至28 ℃，pH值調節至pH 5.0繼續發酵并開始流加甲醇。甲醇的流加速度最初2 h為3 mL/(L·h)，之后每隔1 h增加1 mL/(L·h)。當流速為6 mL/(L·h)后，維持3～4 h。之后以發酵液2.5 L體積分數的0.17%、0.5%、1%每隔1 h補加甲醇，每隔8 h取1次樣測酶活。經過3 d甲醇誘導后，獲得發酵酶液。

1.3.2 生物量和酶活的測量

取1 mL的發酵液于1.5 mL的離心管中， 8 000 r/min離心2 min，倒掉上清液，洗滌烘干后稱量得到菌體的干重[17]。

酶活測量采用高效液相色譜(HPLC)法[18]：量取1.0 mL質量濃度為300 μg/mL的蘆丁標準溶液加入到10 mL的離心管中，再加入980 μL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH 4.0)，漩渦混勻，置于60 ℃ 水浴鍋中保溫10 min，迅速加入20 μL酶溶液，混勻，在60 ℃恒溫水浴鍋中反應15 min后立即放入沸水中滅活12 min，冷卻后過0.22 μm濾膜，空白對照組以滅活的酶液代替原酶溶液，其余步驟同上。然后利用高效液相色譜儀檢測蘆丁含量并依此計算酶活。使用Symmetry C18反相柱，柱溫為35 ℃，紫外檢測波長為280 nm，進樣體積20 μL，流速0.25 mL/min，走樣時間60 min，流動相為A： 0.5%甲酸水溶液，B:乙腈，經優化得出的梯度洗脫條件如表1所示。

表1 液相洗脫條件Table 1 Liquid phase elution conditions

α-L-鼠李糖苷酶酶活力單位的定義(U)：以每分鐘消耗1 μmol蘆丁所需要的酶液量定義為1個α-L-鼠李糖苷酶活力單位。

1.4 固定化酶凝膠顆粒的制備

稱取0.1 g海藻酸鈉和2.4 g聚乙烯醇加入34 mL無菌水加熱溶解，冷卻后加入0.5 mL的戊二醛靜置1 h，在交聯后的溶液中滴加質量濃度為9.3 mg/mL的酶液6 mL，放在恒溫振動器(22 ℃,150 r/min)振動，2 h后加入1.6 g硼酸和0.4 g CaCl2攪拌造粒，15 min后放入質量濃度為10%的Na2SO4中4 h,進行固定化，得到固定化酶凝膠顆粒儲存在pH 4.0的醋酸緩沖液中于4 ℃保存。

1.5 固定化α-L-鼠李糖苷酶性質測定

1.5.1 固定化α-L-鼠李糖苷酶酶活測定

酶活力測定的反應體系：0.98 mL檸檬酸緩沖液(20 mmol/L，pH 4.0)與1 mL質量濃度為300 μg/mL蘆丁底物混合，置于50 ℃條件下溫育10 min后，加入1 g固定化酶液混勻，于50 ℃反應15 min后，立即取出固定化酶，將體系置于100 ℃沸水浴10 min，冷卻至室溫，過0.22 μm水膜后用液相色譜測定蘆丁含量的變化?？瞻追磻菍⒓尤氲拿敢簱Q為100 ℃沸水滅活的酶。

1.5.2 固定化α-L-鼠李糖苷酶最適溫度測定

最適溫度：按一定比例將固定化酶加入到pH值為4的檸檬酸鹽緩沖液中混勻，分別在30、35、40、45、50、55、和60 ℃的酶反應體系下反應15 min，測定α-L-鼠李糖苷酶酶活力，以酶活力最高的為100%，空白組以100 ℃滅活的酶液進行同樣條件的酶反應。

1.5.3 固定化α-L-鼠李糖苷酶最適pH測定

最適pH：按一定比例將固定化酶加入到不同pH(2.0～6.0)的50 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液中，在50 ℃測定α-L-鼠李糖苷酶酶活力，以酶活力最高的為100%，空白組以100 ℃滅活的酶液進行同樣條件的酶反應。

1.5.4 固定化α-L-鼠李糖苷酶底物動力學

以不同質量濃度的(12.5、25.0、50.0、100.0、150.0和200.0 μg/mL)蘆丁為底物，在最適pH和最適溫度的條件下，測定α-L-鼠李糖苷酶酶活力，按照Lineweaver-Burk plots雙倒數曲線作圖法計算重組酶對柚皮苷的米氏常數(Km)。

1.5.5 固定化α-L-鼠李糖苷酶操作半衰期及穩定性

將固定化酶置于pH為4的檸檬酸鹽緩沖液中50 ℃溫浴，每隔1 h取適量固定化酶依酶活反應體系測定酶活，以初始酶活為100%，計算相對酶活。

取適量固定化顆粒，在最適pH和最適溫度的條件下按照酶活反應體系連續進行6批次操作，以最高酶活力作為100%計算相對酶活。

2 結果與討論

2.1 α-L-鼠李糖苷酶發酵結果

α-L-鼠李糖苷酶發酵結果如圖1所示。在5 L發酵罐中，當罐內溶氧量上升時，控制甲醇加入，體積分數分別為0.17%、0.5%和1%時，重組畢赤酵母GS115/pPIC9k-rha的酶活和生物量都呈現出隨誘導時間增加而增加的趨勢，誘導發酵到最后的酶活分別為1 865.8、2 766.0和1 979.9 U/mL，生物量能達到209、228和194 g/L。甲醇在畢赤酵母發酵過程中既是細胞生長所需的碳源又是菌體的能源物質，添加量過少，則菌體沒有足夠的能源用于分泌外源蛋白，故而酶活有所降低；而甲醇添加量如果過高，又會產生毒害作用，抑制細胞的生長甚至引起細胞死亡，同樣會影響酶活結果。所以發酵過程中最適甲醇添加量為發酵液總體積的0.5%。與搖瓶發酵最適條件相比，發酵罐發酵后的酶活是搖瓶的3.89倍[19]。

A-不同甲醇添加量對酶活力的影響；B-不同甲醇添加量對生物量的影響圖1 不同甲醇添加量下酶活與生物量結果Fig.1 Enzyme activity and biomass results of different methanol additives

采用SDS-PAGE鑒定重組α-L-鼠李糖苷酶，得到結果如圖2，泳道中可見一單一條帶，分子質量約100 kDa，與原始黑曲霉α-L-鼠李糖苷酶大小相似。整體來看發酵上清中目的蛋白純度高，雜蛋白含量較低，可直接對發酵上清液進行固定化操作。

圖2 重組α-L-鼠李糖苷酶SDS-PAGE圖Fig.2 SDS-PAGE of recombinant α-L-rhamnosidase

2.2 固定化酶的制備

采用海藻酸鈉聚乙烯醇制備固定化酶凝膠顆粒時，聚乙烯醇有利于增強凝膠的耐久性和機械強度，海藻酸鈉能形成黏稠均勻溶液，可以改善凝膠的表面性質，減少聚集的可能[20]。最終制成的成品如圖3，固定化α-L-鼠李糖苷酶珠子大小均勻，彈性好，圓潤光滑，具有一定的機械強度，酶活為20 U/g，酶活回收率為32.88%。

圖3 制備的固定化α-L-鼠李糖苷酶Fig.3 The picture of immobilized α-L-rhamnosidase

2.3 固定化α-L-鼠李糖苷酶酶學性質研究

2.3.1 固定化酶最適溫度

在酶促反應體系溫度30～60 ℃，pH 4.0的條件下測定酶活力，確定固定化α-L-鼠李糖苷酶的最適溫度。由圖4可知，固定化α-L-鼠李糖苷酶的酶活力隨著溫度上升呈現先增高后降低的趨勢。固定化酶的最適溫度為50 ℃。而由前期實驗得知游離酶的最適溫度為60 ℃。因為固定化載體聚乙烯醇和海藻酸鈉熔點較低，在溫度高于50 ℃后固定化酶的膠質開始融化[21]，受此因素影響使得該方法制備的固定化酶的耐熱性較差。但固定化的α-L-鼠李糖苷酶在35～50 ℃之間維持了較高的催化活性，與游離酶相差不大。

圖4 溫度對固定化α-L-鼠李糖苷酶活力的影響Fig.4 Effect of different temperature on residual activity of immobilized α-L-rhamnosidase

2.3.2 固定化酶最適pH

在溫度為50 ℃的條件下，酶促反應體系的pH分別為2、3、4、5、6時測定固定化α-L-鼠李糖苷酶酶活。在pH為2時海藻酸鈉降解明顯，不能形成凝膠顆粒，所以該固定化酶的起始測定pH值為3。固定化酶最適pH的結果如圖5所示，固定化α-L-鼠李糖苷酶的最適pH范圍在3.0～4.0，與游離酶的最適pH相同。隨著pH的繼續升高，酶活迅速降低，說明該固定化酶是在酸性環境中催化性能較好。

圖5 不同pH對固定化α-L-鼠李糖苷酶活力的影響Fig.5 Effect of different pH on residual activity of immobilized α-L-rhamnosidase

2.3.3 動力學參數的測定分析

在60 ℃下，在pH為4.0的條件下以不同濃度的蘆丁作為底物，測定固定化α-L-鼠李糖苷酶的酶活并計算其反應初速率，以1/[S]為橫坐標，1/[V]為縱坐標制作Lineweaver-Burk雙倒數的擬合曲線，得到動力學結果如圖6，Lineweaver-Burk雙倒數的擬合方程為y=0.449 4x+0.000 16，R2=0.97。計算固定化酶酶解反應的米氏常數Km為0.47 mmol/L，而前期實驗得知游離酶的Km為0.25 mmol/L，酶固定化后的Km值相較于游離酶變大。NUNES[22]等人研究固定柚苷酶的過程中，固定化酶的Km值也比游離酶大，這表明底物固定化以后由于樹脂載體內部的空間位阻和擴散效應造成酶與底物的親和性降低，反應初速率有一定增大。

圖6 固定化α-L-鼠李糖苷酶的Lineweaver-Burk圖Fig.6 Lineweaver-Burk plot for immobilized α-L-rhamnosidase

2.3.4 半衰期及操作穩定性

重組α-L-鼠李糖苷酶的半衰期如圖7所示，在6 h的時候，酶活下降為初始酶活的50%。隨著操作次數的增多，反應體系中固定化α-L-鼠李糖苷酶的酶活變化情況如圖7所示。

A-固定化α-L-鼠李糖苷酶的半衰期；B-固定化α-L-鼠李糖苷酶操作穩定性圖7 固定化α-L-鼠李糖苷酶的半衰期和操作穩定性Fig.7 Half-life and operation stability of immobilized α-L-rhamnosidase

固定化α-L-鼠李糖苷酶的酶活隨著反應次數的增多而逐步上升。出現這種情況的原因可能是初始階段的聚乙烯醇-海藻酸鈉載體強度較大但傳質性能比較差，產生了一定的空間位組和屏蔽作用，從而對酶的活性產生影響[16]。而后隨著反應次數的增加，載體強度減弱，被包埋的酶漸漸與底物接觸，蘆丁轉化強度變大，連續使用了6次后凝膠顆?；旧弦呀浱幱谕该髂z化的狀態，但相對酶活還能保持在98.22%。說明該固定化α-L-鼠李糖苷酶有著比較好的操作穩定性，利于重復利用，具工業化大規模生產的潛能。

3 結論

本文對重組黑曲霉α-L-鼠李糖苷酶進行了5 L罐高密度發酵和酶固定化實驗，并對固定化α-L-鼠李糖苷酶性質進行了測定。通過采取不同甲醇流加量發現當甲醇添加的體積分數為0.5%時，酶活力達到最高2 766 U/mL ；采用質量分數1%海藻酸鈉和體積分數10%戊二醛交聯制作固定化α-L-鼠李糖苷酶，其最適溫度為40 ℃，最適pH為4.0，固定化α-L-鼠李糖苷酶的酶活為20 U/g，酶活回收率為32.88%。以高密度發酵α-L-鼠李糖苷酶并進行固定化，為今后發酵工藝的進一步放大及α-L-鼠李糖苷酶制備異槲皮苷的工業化生產提供了理論依據和指導。