產L-絲氨酸谷氨酸棒桿菌誘變后突變基因對生長和產酸的影響

陳紫薇，張曉梅，史勁松，許正宏,2*

1(江南大學 藥學院，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

L-絲氨酸是一種非必需氨基酸，在醫藥、食品、化妝品等領域有著廣泛的應用，年需求量大約是3 000 t[1]。谷氨酸棒桿菌是食品安全級氨基酸生產菌株，廣泛應用于L-谷氨酸、L-賴氨酸、L-纈氨酸等氨基酸的生產[2]。然而一般的谷氨酸棒桿菌卻不能利用糖質原料發酵生產L-絲氨酸。

目前國內外對谷氨酸棒桿菌產L-絲氨酸的研究集中在其合成和降解途徑的分子改造，STOLZ等以不產L-絲氨酸的谷氨酸棒桿菌ATCC13032為出發菌株，構建的重組菌以葡萄糖和果糖為混合碳源時L-絲氨酸產量36.2 g/L[3-4]。來書娟等在谷氨酸棒桿菌ATCC13032中加強表達3-磷酸甘油酸激酶(PGK)，增加了L-絲氨酸前體3-磷酸甘油酸的合成，提高了L-絲氨酸的產量[5]。

本課題組前期從自然界中篩選得到1株能利用糖質原料發酵產L-絲氨酸的野生型谷氨酸棒桿菌SYPS-062，以它為出發菌株通過多輪化學誘變獲得突變株SYPS-062-33a[6]。該突變株L-絲氨酸產量提高65%，達到11.0 g/L，副產物L-丙氨酸和L-纈氨酸的積累量也明顯提高。進一步在突變株上解除L-絲氨酸合成途徑關鍵酶反饋抑制，敲除降解途徑，阻斷和弱化副產物積累途徑，所獲得重組菌ΔSSAAI其L-絲氨酸搖瓶產量可以達到26.25 g/L，是野生型菌株的3.9倍。在5 L發酵罐上補料分批發酵，L-絲氨酸的產量達到42.62 g/L[7-8]。然而谷氨酸棒桿菌SYPS-062為什么會積累絲氨酸，突變株SYPS-062-33a高產機制并不清晰。對突變株SYPS-062-33a和野生型菌株SYPS-062進行全基因組測序，解析基因組與表型之間的關系，尋找新的菌株改造的靶點。與SYPS-062相比，SYPS-062-33a有25個基因發生突變，其中12個基因發生了非同義突變，對其中5個突變的基因做回復突變或者敲除的研究，發現其中丙酮酸脫氫酶亞基aceE點突變與突變株SYPS-062-33a丙氨酸、纈氨酸積累量增加有直接關系[9]。本研究在前期基礎上，通過在高產L-絲氨酸菌株ΔSSAAI中分別敲除剩余7個發生突變的功能基因，進一步探討其余7個突變基因對菌株產酸和生長的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和引物

產L-絲氨酸的谷氨酸棒桿菌ΔSSAAI為研究室前期構建并保藏；大腸桿菌JM109為實驗室保藏；谷氨酸棒桿菌敲除質粒pK18mobsacB為實驗室保藏[10]；大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭表達質粒pDXW-10為王小元實驗室饋贈[11]。實驗涉及引物見表1。

表1 文中所用到的主要引物Table 1 Primers used in this study

注：酶切位點用下劃線標注。

1.1.2 試劑

涉及DNA相關操作分子試劑盒均購于上海捷瑞公司；分子操作涉及到的工具酶均購于TaKaRa；蔗糖、磷酸二氫鈉、瓊脂粉等配制培養基的試劑均購于國藥試劑有限公司；腦心浸液(BHI)、原兒茶酸、生物素等購于sigma公司；硫酸卡那霉素購于上海生物工程有限公司。

1.1.3 培養基

(1)LB 培養基(g/L)：蛋白胨 10，酵母粉 5，氯化鈉 10(固體培養基，瓊脂粉 20)；121 ℃滅菌20 min；

(2)種子培養基(g/L)：腦心浸液 37，葡萄糖 20，(NH4)2SO410，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO40.2，NaH2PO40.3；

(3)發酵培養基(g/L)：蔗糖 100，CaCO360，KH2PO43，(NH4)2SO430，MgSO4·7H2O 0.5，FeSO4·7H2O 0.02，MnSO4·H2O 0.02，原兒茶酸 0.03，生物素 5×10-5，鹽酸硫胺素 4.5×10-4；115 ℃滅菌7 min；

(4)谷氨酸棒桿菌感受態培養基(g/L)：蛋白胨 10，酵母粉 5，氯化鈉 10，Tween-80 1，甘氨酸 25；121 ℃滅菌20 min；

(5)谷氨酸棒桿菌電轉化培養基(g/L)：蛋白胨 5，酵母粉 2.5，氯化鈉 5，腦心浸液 18.5，山梨醇 91；121 ℃滅菌20 min；

(6)10%蔗糖篩選培養基(g/L)：腦心浸液 37；蔗糖 100；(NH4)2SO410；MgSO4·7H2O 0.5；K2HPO40.2；NaH2PO40.3；瓊脂粉 20；滅菌條件：115 ℃，7 min。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒的構建

敲除質粒的構建：以敲除基因SD36_RS01255為例，將谷氨酸棒桿菌ΔSSAAI基因組作為模板，利用引物1255-1/2，1255-3/4分別擴增基因SD36_RS01255上下游同源臂片段，然后以擴增得到的同源臂為模板利用引物1255-1/4進行二輪擴增，得到目的基因截短的同源臂。將得到的同源臂和敲除質粒pK18mobsacB用限制性內切酶EcoRI、XbaI雙酶切，利用T4 DNA ligase連接，得到重組敲除質粒。

回復突變的重組質粒的構建：基因回復突變是利用質粒pK18mobsacB實現。以SYPS-062的基因組為模板，利用引物1255M-F/R擴增目的基因，目的基因和敲除質粒pK18mobsacB用限制性內切酶EcoRI、XbaI雙酶切，利用T4 DNA ligase連接，得到回復突變的重組質粒。

過表達質粒的構建：以谷氨酸棒桿菌ΔSSAAI基因組為模板，利用引物1255-for/rev擴增基因SD36_RS01255，將目的基因片段和質粒pDXW-10用限制性內切酶EcoRI、pstI雙酶切，利用T4 DNA ligase連接，得到重組質粒。

1.2.2 重組菌的構建

敲除與回復突變重組菌的構建：制備ΔSSAAI電轉化感受態細胞，將相應的重組質粒電轉入ΔSSAAI感受態細胞，電轉化條件1.8 kV、5 ms，在谷氨酸棒桿菌電轉化培養基中加入適量的硫酸卡那霉素(50 mg/mL)篩選陽性轉化子，陽性轉化子在10%蔗糖培養基進行二次篩選，得到的轉化子進行PCR擴增或者測序驗證。

過表達重組菌的構建：制備ΔSSAAI電轉化感受態細胞，將重組過表達質粒電轉入ΔSSAAI感受態細胞，電轉化條件1.8 kV、5 ms，在谷氨酸棒桿菌電轉化培養基中加入適量的硫酸卡那霉素(50 mg/mL)篩選陽性轉化子，最終提取質粒，通過PCR及雙酶切驗證，得到過表達重組菌。

1.2.3 發酵參數的測定

生物量的測定：發酵液用1 mol/L HCl稀釋至一定濃度，紫外分光光度計檢測OD562。

L-絲氨酸和糖濃度的測定：采用HPLC測定發酵液中糖及L-絲氨酸產量[8]。

2 結果與分析

2.1 差異基因分析及基因敲除菌株的構建

2.1.1 突變株SYPS-062-33a和野生型菌株SYPS-062差異基因分析

SYPS-062-33a與SYPS-062比較基因組學研究結果表明，有12個基因發生了非同義突變，對其中5個突變的基因做回復突變或者敲除的研究，發現其中丙酮酸脫氫酶亞基aceE點突變與突變株SYPS-062-33a丙氨酸、纈氨酸積累量增加有直接關系[9]。本文對剩余7差異基因進行研究分析。SYPS-062-33a和野生型菌株SYPS-062的7個突變基因見表2。

表2 SYPS-062-33a與SYPS-062差異基因分析Table 2 The variant genes between SYPS-062-33a andSYPS-062

2.1.2 基因敲除菌株的構建

利用pk18mobsacB敲除質粒在ΔSSAAI基因組上分別敲除7個差異基因，構建重組菌ΔSSAAIΔ1，ΔSSAAIΔ2，ΔSSAAIΔ3，ΔSSAAIΔ4，ΔSSAAIΔ5，ΔSSAAIΔ6，ΔSSAAIΔ7。利用PCR擴增驗證，結果如圖1A所示，泳道1，3，5，7，9，11，13對應ΔSSAAI編號1～7基因擴增的片段明顯長于泳道2，4，6，8，10，12，14敲除重組菌編號1～7基因擴增的片段，所以基因敲除重組菌構建成功。

A-敲除重組菌驗證：M-marker；1，3，5，7，9，11，13-對照菌株PCR擴增結果；2，4，6，8，10，12，14-敲除菌株PCR擴增結果;B-過表達重組菌驗證：M-marker；1-PCR擴增驗證;2-雙酶切驗證圖1 重組菌構建結果Fig.1 Verification of recombinant strains

2.2 基因敲除菌株的發酵

在以100 g/L蔗糖為底物的發酵培養基中比較基因敲除菌株和出發菌ΔSSAAI的發酵性能。如圖2所示，分別敲除編號為1，4，5基因，發酵120 h時，L-絲氨酸的產量和菌體生長與對照菌株ΔSSAAI相比未見明顯變化；敲除基因2后，菌體生長與對照ΔSSAAI相比提高了5.2%，L-絲氨酸的產量無明顯變化；分別敲除基因6，7后，L-絲氨酸的產量和菌體的生長都略有降低，說明敲除這幾個基因對菌株ΔSSAAI生長和L-絲氨酸產量的影響并不顯著。但是敲除基因3后，構建的重組菌株ΔSSAAIΔ3只積累19.52 g/L的L-絲氨酸，與對照菌株相比下降26.4%。在整個發酵階段，重組菌生長以及糖耗也都有顯著下降，對照菌ΔSSAAI在24 h就進入了對數生長期，菌體快速地增長，而ΔSSAAIΔ3在24 h時還處于遲滯期，菌體增長緩慢。發酵到120 h時，其最大生物量OD562為38.70，而對照菌株OD562為52.14，下降25.8%。由此可見敲除基因3后，會引起菌株遲滯期延長，導致重組菌生長緩慢和產酸下降(圖3)。

圖2 基因敲除重組菌L-絲氨酸的產量和生長Fig.2 L-serine production and cell growth of gene deletion recombinant strains

基因3敲除引起L-絲氨酸的產量、生長以及糖耗都有顯著下降，但是單位菌體的產酸量與對照相比并沒有顯著變化，而氨基酸作為初級代謝產物，產量的積累與生長是呈偶聯關系，所以基因3敲除后，很有可能是通過影響菌體的生長，導致L-絲氨酸的產量下降。然而基因3的功能沒有注釋，無法定位其參與的代謝途徑，隨后將在ΔSSAAI中對基因3進行回復突變，分析其對生長和產酸的影響。

2.3 回復突變對ΔSSAAI發酵的影響

利用pk18mobsacB質粒，參照1.2.2構建基因3回復突變重組菌ΔSSAAI(3L24P)，在發酵培養基中評價其發酵特性。如圖3所示，發酵120 h時，ΔSSAAI(3L24P)的OD562為49.40，積累24.62 g/L的L-絲氨酸，與對照相比分別下降5.3%，7.2%。說明基因3的突變對菌株生長和產酸確實有一定的影響，隨后將進一步分析基因3編碼的蛋白功能，研究加強表達基因3對ΔSSAAI生長及發酵產酸的影響。

A-生長； B-L-絲氨酸產量；C-糖耗圖3 基因3敲除與回復突變重組菌發酵特性Fig.3 Fermentation profile of gene three deletion and reverse mutation recombinant strain

2.4 基因3編碼的蛋白質理化性質及功能的預測

基因3序列全長897 bp，共編碼298個氨基酸，蛋白質分子量為32 839 Da，通過DNAMAN軟件預測理論的等電點pI為4.17。DNAMAN軟件分析親水性/疏水性的結果如圖4-A所示。由圖4-A可知，親水和疏水性的氨基酸在肽鏈上分布較為均勻。利用在線工具SOPMA(https://prabi.ibcp.fr/htm/site/web/home)對二級結構進行預測分析，基因3編碼的多肽鏈可以形成α-螺旋，β-折疊，β-轉角，無規卷曲4種二級結構，主要以無規卷曲和α螺旋為主，分別占39.93%和35.57%。

利用NCBI網站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的BLAST在線工具[12]，將基因3的蛋白序列與已知的蛋白序列進行比對，初步預測蛋白的功能。基因3編碼的蛋白序列經過BLAST比對后得到結果見圖4-B。比對的結果顯示，基因3編碼的蛋白的47～137氨基酸的組成與毛根農桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)質粒pRiA4b ORF-3編碼的蛋白類似。這個家族的一些蛋白被注釋為lexA調節子， 含有與lexADNA結合的結構域。lexA能夠阻遏沉默SOS應答，SOS應答與DNA 的修復有關[13]，使細菌的分裂受到抑制，影響細菌的生長。同樣JOCHMANN等在C.glutamicumATCC13032中敲除lexA，發現菌株生長明顯減弱，遲滯期明顯延長[13]。由此我們推測基因3的功能與DNA修復有關。

圖4 基因3編碼蛋白的特性Fig.4 The characteristics of the protein encode by gene 3

2.5 過表達基因3對ΔSSAAI發酵的影響

基因3的敲除導致ΔSSAAI的生長和L-絲氨酸的產量均有下降，繼而通過過表達基因3研究其對ΔSSAAI生長及發酵產酸的影響。參照1.2.2構建過表達重組菌ΔSSAAI-3，提取質粒通過PCR擴增和酶切驗證表明重組菌構建成功(圖1-B)，隨后在發酵培養基中評價其發酵特性。如圖5所示，ΔSSAAI-3與對照相比，其生長、L-絲氨酸的產量以及糖耗未發生顯著變化。說明基因3過表達對ΔSSAAI發酵性能沒有顯著影響，推測其原因是基因3編碼蛋白的本底表達量就能滿足菌體的需求。

A-生長；B-L-絲氨酸產量；C-糖耗圖5 基因3過表達重組菌發酵特性Fig.5 Fermentation profile of gene three overexpression recombinant strain

3 結論

本課題組在前期研究中，以谷氨酸棒桿菌SYPS-062為出發菌，通過誘變得到高產L-絲氨酸的突變株SYPS-062-33a。對突變株SYPS-062-33a和出發菌株SYPS-062進行比較基因組學分析，發現12個基因發生了非同義突變，將其中5個突變的基因做回復突變或者敲除的研究，發現其中丙酮酸脫氫酶亞基aceE點突變與突變株SYPS-062-33a丙氨酸、纈氨酸積累量增加有直接關系。本文對其余7個發生突變的基因進行研究，利用基因敲除的手段在高產L-絲氨酸菌株ΔSSAAI進行7個基因研究，發現敲除基因3構建的重組菌ΔSSAAIΔ3，菌株生長、L-絲氨酸的產量顯著下降。對基因3編碼的蛋白進行理化性質分析，與NCBI數據庫蛋白比對后，發現敲除基因3可能影響菌體DNA修復，從而造成生長緩慢，影響L-絲氨酸的產量。而在ΔSSAAI中采用質粒加強表達基因3，對ΔSSAAI的生長、L-絲氨酸的產量未造成顯著影響，今后將對基因3編碼的蛋白的功能進行深入研究，探索敲除基因3對菌體生長和產酸影響的機制。