阪崎腸桿菌生物膜形成條件及超聲波對其去除作用

楊璐環，鄧一秒，吳希陽，陳振強，唐書澤*

1(暨南大學 食品科學與工程系，廣東 廣州，510632) 2(暨南大學 食品安全與營養研究院，廣東 廣州，510632) 3(暨南大學 光電工程系，廣東 廣州，510632)

阪崎腸桿菌(Cronobactersakazakii)是一種危及嬰幼兒健康的條件致病菌。1961年，英國首次報道了兩例由阪崎腸桿菌引起的新生兒腦膜炎病例，兩個嬰兒在出現癥狀后的兩天內均死亡[1]。之后，科研人員從食品和環境中分離出阪崎腸桿菌，2002年LECLERCQ[2]等從奶酪、牛肉、蔬菜、臘腸中分離到阪崎腸桿菌, 但目前還不能確定該菌的自然宿主。近年，在美國、日本、墨西哥、阿根廷等地都出現過奶粉阪崎腸桿菌感染嬰幼兒病例[3-6]。低體重、早產嬰兒與免疫缺陷嬰兒是易感人群，感染癥狀主要是腦膜炎、菌血癥和小腸結腸炎[7]。在中國，雖阪崎腸桿菌中毒事件的報道鮮少，但在廣州、甘肅、福建龍巖等多地市售嬰幼兒奶粉中曾分離出阪崎腸桿菌[8-10]。

多年來，學者主要研究的是浮游菌，但大多數細菌是以群體方式存在，即生物膜(biofilm)形式。阪崎腸桿菌主要以生物膜方式存在，附著在加工生產線、車間墻壁、地面等表面，是一個三維結構菌細胞群體，被胞外聚合物(extracellular polymeric substance, EPS)及其基質網包裹。其形成過程包括可逆附著期、不可逆附著期、菌落形成期、成熟期及老化脫落期[11]。時間、溫度、pH值、營養條件、有機化合物、金屬離子尤其是二價離子如Ca2+、Mg2+、Cu2+等因素都會影響生物膜的形成。細菌生物膜極易出現在被忽略的隱蔽處如凹槽、空隙等，在食品加工過程中，食品通過接觸這些微小地方染菌，引發食品中毒。生物膜控制方法有超聲波法、消毒劑清洗消毒法等[12]。超聲波可以在鄰近表面的液體中產生空化氣泡，從而分散在生物膜的表面而去除生物膜[13]。DROR等[14]研究表明超聲波處理能有效去除87.5%的生物膜。超聲處理初始溫度、時間、功率等都能影響生物膜去除效果。BAUMANN等[15]對單核細胞李斯特菌生物膜研究結果表明超聲波與臭氧處理結合能有效去除食品不銹鋼表面生物膜。TORLAK等[16]認為超聲波與苯扎氯銨聯合作用能導致生物膜中活細胞水平顯著降低。

阪崎腸桿菌近年來在食品中尤其是奶粉中的檢出率逐年增加，周漢洪等[17]對四川省達州市嬰幼兒食品阪崎腸桿菌污染情況進行檢測，檢測率高達26.83%。但對阪崎腸桿菌生物膜的形成因素和控制技術研究報道甚少，本文通過建立生物膜體外模型，測定生物膜含量并觀察其形態變化，探討阪崎腸桿菌生物膜形成條件，同時通過超聲波處理，研究超聲波作用對玻璃表面生物膜去除效果。

1 材料與方法

1.1 菌株及培養基

阪崎腸桿菌標準菌株ATCC29544(含標準凍干菌株與菌株復蘇液)，購自廣東環凱微生物科技有限公司。

胰蛋白胨大豆肉湯培養基 (TSB)：稱取15.0 g加入500 mL蒸餾水，混勻溶解后，121 ℃高壓滅菌15 min，4 ℃保存備用。

胰蛋白胨大豆瓊脂培養基 (TSA)：稱取干粉20.0 g加入500 mL蒸餾水，121 ℃高壓滅菌15 min，待冷卻到45 ℃倒平板，4 ℃保存備用。

1.2 主要試劑

pH=7.4 無菌磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer solutions，PBS)(本實驗室配置)； 結晶紫(Sigma);甲醇、體積分數為33%冰乙酸(天津市大茂化學試劑廠)；LIVE/DEADTMBacLightTMBacterial Viability Kit (L13152，含SYTO9/PI)；抗熒光淬滅劑(碧云天P0126)；指甲油 (浙江艷莊化妝品有限公司)。

1.3 主要儀器

多功能酶標儀 (Infiniti M200pro，Switzerland)，帝肯貿易有限公司；6/96孔細胞培養板，Costar；蓋玻片 (玻璃材質，20 mm×20 mm)，載玻片(玻璃材質，25 mm×75 mm)，江蘇世泰實驗器材有限公司；智能數字超聲儀器(KQ-350D)，東莞市科橋超聲波設備有限公司；倒置生物顯微鏡 (BDS400)，重慶奧特光學儀器有限公司；激光共聚焦掃描顯微鏡 (LSM700)，德國Zeiss。

1.4 方法

1.4.1 菌種復蘇與活化

參照微生物檢測凍干質控菌種阪崎腸桿菌使用說明書對菌種進行復蘇，開啟瓶蓋前需用體積分數為75%酒精棉球對瓶子表面進行消毒，所有操作均在無菌條件下進行。復蘇后的菌懸液于5 mL TSB培養基中以100 r/min、37 ℃下進行搖床培養過夜。

1.4.2 菌種培養

取活化后的菌懸液100 μL涂布于TSA培養基，在生化培養箱中37 ℃培養過夜。挑取菌落在TSA中采用分區劃線稀釋法進行平板劃線，培養繁殖過夜后形成阪崎腸桿菌單菌落。挑取單個菌落加入5 mL TSB培養基中，在37 ℃、100 r/min進行搖床培養16 h至生長穩定期得到種子液[18]。對得到的菌懸液以4 500 r/min離心10 min，棄去上清液培養基，收集菌體沉淀，加5 mL 無菌PBS對菌體洗滌3次，棄去上清液浮游菌，使菌體重新懸浮于PBS溶液，用酶標儀在595 nm測光密度(optical density, OD)，用無菌PBS調整菌懸液OD595值為0.5，用于后續實驗。

1.4.3 阪崎腸桿菌BF體外模型建立與測定

1.4.3.1 96孔細胞培養板BF形成與測定

96孔培養板在體積分數為75%酒精浸泡過夜，超凈工作臺中紫外殺菌30 min。吸取100 μL菌液與100 μL TSB培養基加入至96孔培養板中混勻，以加入200 μL TSB培養基孔作為陰性對照，置生化培養箱37 ℃培養24 h，吸出培養液，加入200 μL無菌PBS洗滌3次以洗去浮游菌。以結晶紫染色法測OD值，步驟參照 LEE[19]等進行適當修改：加100 μL體積分數為10%甲醇固定15 min，吸出甲醇，自然風干，加200 μL質量分數為1%結晶紫染色15 min，吸出結晶紫，用無菌蒸餾水清洗3次至無色，自然干燥后加200 μL 33%冰乙酸，37 ℃培養箱中靜置20 min以完全溶解染料，多功能酶標儀在595 nm測定其OD值。

1.4.3.2 6孔細胞培養板載玻片BF形成

6孔培養板、蓋玻片在體積分數為75%酒精浸泡過夜，超凈工作臺中紫外殺菌30 min。將蓋玻片轉移至6孔培養板，并吸取200 μL菌液與5 mL TSB培養基加入至6孔培養板中。置生化培養箱37 ℃培養24 h，無菌PBS洗滌3次以洗去蓋玻片的浮游菌。

1.4.4 培養溫度與培養基初始pH值對阪崎腸桿菌生物膜形成的影響

按1.4.3.1阪崎腸桿菌形成生物膜方法，用體積分數為10% HCl和質量分數為10% NaOH調節配制初始pH值為2.0、3.0、5.0、6.5、7.0、7.5、8.0、10.0、12.0的TSB培養基，121 ℃高壓滅菌15 min后，將其分別放于4、25、37、45、55 ℃培養箱中培養，作空白對照。按1.4.3.1操作測定OD值，每組試驗設置6個平行，試驗重復3次，取平均值。

1.4.5 倒置顯微鏡觀察37 ℃下不同pH值生長條件下的生物膜

按1.4.3.1阪崎腸桿菌形成生物膜方法，配制初始pH值為2、5、7.5、10、12的TSB培養基，采用結晶紫染色法在倒置顯微鏡觀察生物膜，96孔板可直接放在倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.4.6 培養基成分對阪崎腸桿菌生物膜形成的影響

按1.4.3.1操作，各組分別以不加NaCl，CaCl2，MgCl2，CuSO4，乙二胺四乙酸 (ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA) 作為陽性對照，37 ℃培養24 h，不加菌液培養基作陰性對照。按1.4.3.1操作測定OD值，每組試驗設置6個平行，試驗重復3次，取平均值。

1.4.6.1 鹽度對阪崎腸桿菌生物膜形成的影響

向TSB培養基中添加NaCl至質量分數為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%，121 ℃高壓滅菌15 min后按1.4.3.1操作測定OD值。

1.4.6.2 無機鹽Ca2+、Mg2+、Cu2+對阪崎腸桿菌生物膜形成的影響

分別配制含質量分數為0.01%、0.03%、0.05%、0.10%、0.50%、1.00%、1.50%、2.00%的CaCl2的TSB培養基；配制含質量分數0.05%、0.10%、0.50%、1.00%、1.50%、2.00%、2.50%、3.00%的MgCl2的TSB培養基；配制含質量分數為0.05%、0.10%、0.30%、0.50%、0.80%、1.00%、1.50%、2.00%的CuSO4的TSB培養基，121 ℃高壓滅菌15 min后按1.4.3.1操作測定OD值。

1.4.6.3 有機化合物EDTA對阪崎腸桿菌生物膜形成的影響

配制含質量分數為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的EDTA的TSB培養基，121 ℃高壓滅菌15 min后按1.4.3.1操作測定OD值。

1.4.7 超聲波法對玻璃表面阪崎腸桿菌生物膜去除作用

1.4.7.1 超聲波法對玻璃表面阪崎腸桿菌生物膜處理及平板菌落計數法

按1.4.3.2處理后將洗好的蓋玻片轉移至裝有10 mL無菌水的無菌離心管中，密封。對其進行超聲波處理，混勻所得菌懸液，將其以十倍稀釋法進行稀釋，選取合適的梯度以涂布平板法進行計數，每個梯度設置3個平行。若不進行稀釋，則培養過夜后，培養基上的菌落會成片，致無法計數。從冰箱拿出的TSA培養基需倒置放入37 ℃培養箱中靜置2 h，防止培養基含水分從而稀釋菌液且延長涂布時間。吸取100 μL菌液滴加至滅菌的TSA培養基中，用涂布器進行涂布，使菌液均勻分布，于37 ℃培養16～24 h后進行菌落計數。試驗重復3次，取平均值。計算公式如下：

玻璃表面脫落 菌落數(CFU/cm3)=

(1)

1.4.7.2 超聲初始溫度對玻璃表面阪崎腸桿菌生物膜去除作用的影響

設定超聲波功率為180 W，分別在超聲初始溫度為20 、25 、30 、35 、40 、45 、50 、55 ℃超聲處理5 min，按1.4.7.1以平板菌落計數法進行計數，記錄結果并計算出玻璃表面脫落菌落數，以確定最佳的超聲初始溫度。

1.4.7.3 超聲時間對玻璃表面阪崎腸桿菌生物膜去除作用的影響

設定超聲波初始溫度為30 ℃，超聲功率為180 W，分別對其進行超聲處理2、5、8、11、14、17、20、23 min，按1.4.7.1以平板菌落計數法進行計數，記錄結果并計算出玻璃表面脫落菌落數，以確定最佳的超聲時間。

1.4.7.4 激光共聚焦掃描(CLSM)觀察超聲初始溫度對玻璃表面阪崎腸桿菌生物膜去除作用影響

按照活SYTO9/PI染料試劑盒說明書進行操作，加100 μL 染料，染色孵育15 min，在載玻片上滴加1滴抗熒光淬滅劑，指甲油封片，于激光共聚焦掃描顯微鏡觀察，采集圖像。

1.4.7.5 激光共聚焦掃描(CLSM)觀察超聲時間對玻璃表面阪崎腸桿菌生物膜去除作用影響

按1.4.7.4步驟操作。

2 結果與分析

2.1 溫度與培養基初始pH值對阪崎腸桿菌生物膜形成的影響

培養溫度、培養基初始pH值和生物膜形成密切關系(見圖1)。阪崎腸桿菌在37 ℃生長狀況最好，45 ℃環境下的阪崎腸桿菌生物膜量比25 ℃時多，這與魏奇等[20]報道一致。在4 ℃低溫下，阪崎腸桿菌基本不生長，在55 ℃環境中培養阪崎腸桿菌，其也形成了一定數量的生物膜，證明了阪崎腸桿菌的耐高溫特性，也說明了在奶粉等食品中需要60 ℃以上才能達到殺滅阪崎腸桿菌目的。在一定的溫度下，阪崎腸桿菌的生長受初始pH值的影響較大，當培養基為堿性時，其生長嚴重受到抑制，當培養基為酸性時，其生長也受到抑制，但影響相對較小。當初始pH值為2.0～7.5時，生物膜量隨之增加，初始pH值為7.5的生物膜量最大，最適合阪崎腸桿菌生長。當初始pH值為8.0～12.0時生物膜量隨之迅速減少，且pH值為2.0時的生物膜量比初始pH值為12.0時多，pH值為12.0時基本不形成生物膜，說明阪崎腸桿菌具有耐酸性。

圖1 阪崎腸桿菌生物膜培養光密度值隨培養基初始pH值與溫度的變化Fig.1 Influence of medium initial pH and temperature on the opticaldensity of Cronobacter sakazakii

2.2 倒置顯微鏡觀察37℃下不同pH值生長條件下的生物膜

圖2-a為空白對照組圖，即未加入菌懸液的TSB培養基組。圖中未觀察到紫色菌體，表明無生物膜形成。圖2-b為培養基初始pH值2.0時顯微鏡觀察圖，可明顯看出其已有少量生物膜形成。圖2-c顯示，培養基初始pH值為5.0時的生物膜量比培養基初始pH值為2.0時多，且染色顏色深，證明生物膜較成熟，胞外多糖與結晶紫形成緊密。圖2-d為阪崎腸桿菌在最適培養基初始pH值為7.5時觀察圖，可看出其生物膜已經完全成熟。圖2-e表明，當培養基初始pH值增大為10.0時，生物膜含量大大降低。從圖2-f可看出，當培養基初始pH值為12.0時，幾乎不形成生物膜。圖2-b與圖2-f比較，培養基初始pH值為酸性時的生物膜量比培養基初始pH值為堿性時要多，進一步說明阪崎腸桿菌的耐酸特性。

圖2 不同pH值下阪崎腸桿菌生物膜結晶紫染色倒置顯微鏡鏡檢 10×20(結晶紫染色×200)Fig.2 Inverted microscope observations of Cronobacter sakazakii biofilm by crystal violet staining with different pH注：a為空白對照組，b～f分別表示在培養基初始pH為2.0、5.0、7.5、10.0、12.0條件下阪崎腸桿菌生物膜倒置顯微鏡下觀察圖。

2.3 培養基成分對阪崎腸桿菌生物膜形成的影響

2.3.1 鹽度對阪崎腸桿菌生物膜形成影響

阪崎腸桿菌生物膜在培養基鹽度0.5%～3.0%范圍內形成狀況較好，OD值比較高(見圖3)。鹽度2.5%時，為阪崎腸桿菌生長最優參數。隨著鹽度增長，阪崎腸桿菌生長被抑制，生長速率降低，鹽度為3.0%～7.0%時，生物膜量持續下降，但鹽度為7.0%時，仍有一定的生物膜形成。

2.3.2 無機鹽Ca2+、Mg2+、Cu2+對阪崎腸桿菌生物膜形成的影響

圖4為無機鹽Ca2+、Mg2+、Cu2+對不同質量分數條件下測的OD595nm值。CaCl2質量分數相對較低時，CaCl2明顯促進生物膜的形成，待CaCl2質量分數達到0.50%，達到最高生物膜量，但隨著質量分數的增加，生物膜生長被抑制。在Ca2+質量分數低于2.00%時，生物膜量總體呈上升趨勢(見圖4-A)。CHEN等[21]通過研究Ca2+對副溶血弧菌影響后指出，Ca2+可能是可交聯的陰離子基質聚合物，當Ca2+濃度增加，使得Ca2+飽和，其可屏蔽靜電相互作用并改變生物膜，使得形成的生物膜量下降。

MgCl2總體上是促進生物膜形成(見圖4-B)，MgCl2質量分數0.01%～1.50%時，生物膜量持續增加，1.50%時達到最大。Mg2+通過對負電荷的吸引，使菌體粘附于載體的機會增大[22]。當濃度再升高時，生物膜形成量降低，SONG和LEFF[23]研究Mg2+對熒光假單胞菌的影響規律，表明Mg2+改變了生物膜結構，從而影響其生物膜的形成。

Cu2+明顯抑制生物膜形成(圖4-C)。Cu2+在質量分數0.50%時，生物膜量下降較明顯。當Cu2+質量分數1.50%時，幾乎不形成生物膜，其他試驗組的生物膜量也明顯低于對照組。Cu2+是重金屬離子，毒性較強，抑制生物膜活性，減少EPS分泌[24]。

圖4 無機鹽對阪崎腸桿菌生物膜形成的影響Fig.4 Effect of inorganic salts on Cronobacter sakazakii biofilm formation

2.3.3 有機化合物EDTA對阪崎腸桿菌生物膜形成的影響

圖5結果表明，添加0.2%EDTA，生物膜量稍增加，EDTA濃度增加，生物膜形成受到明顯抑制，添加2.5%EDTA時，生物膜幾乎不形成。 EMMAJ[25]等研究隱球菌生物膜形成影響因素時，發現EDTA通過影響Ca2+、Mg2+的運輸，抑制生物膜形成。

圖5 EDTA對阪崎腸桿菌生物膜形成的影響Fig.5 Effect of EDTA on Cronobacter sakazakii biofilm formation

2.4 超聲波法對玻璃表面阪崎腸桿菌生物膜去除作用的影響

2.4.1 超聲初始溫度對玻璃表面阪崎腸桿菌生物膜去除作用的影響

超聲初始溫度對玻璃表面阪崎腸桿菌去除作用有一定的影響(見圖6)。超聲初始溫度低意味著超聲過程中產生的熱量少，隨著超聲初始溫度的升高，脫落的活菌數越多，初始溫度為30 ℃時，效果最好。當初始溫度繼續升高，脫落的活菌數下降，但仍較高，當初始溫度超過50 ℃時，超聲產熱過多導致阪崎腸桿菌失活，從而使活菌脫落數降低。本實驗結果表明，超聲波解離阪崎腸桿菌菌株生物膜最優超聲初始溫度為30 ℃。

圖6 超聲波初始溫度對阪崎腸桿菌玻璃表面生物膜去除影響Fig.6 Effect of ultrasonic initial temperature on lg(CFU/cm3) elimination of Cronobacter sakazakii biofilm on glass surface

2.4.2 超聲時間對玻璃表面阪崎腸桿菌生物膜去除作用的影響

超聲時間對玻璃表面阪崎腸桿菌生物膜去除作用有顯著影響(見圖7)。

圖7 超聲波時間對阪崎腸桿菌玻璃表面生物膜去除影響Fig.7 Effect of ultrasonic time on lg(CFU/cm3) elimination of Cronobacter sakazakii biofilm on glass surface

當超聲時間為2 min時，生物膜脫落效果不顯著。這是因為生物膜有穩定的結構，需要一定的時間才能達到良好效果。隨著時間的延長，活菌脫落數大幅度上升，當時間14 min時，脫落效果最好。但繼續進行超聲處理，其脫落效果下降，這可能是因為處理時間越久，溫度越高。處理時間過長與溫度過高導致菌體損失，致其死亡。本實驗結果表明，超聲波解離阪崎腸桿菌菌株生物膜最優超聲時間為14 min。

2.4.3 激光共聚焦顯微鏡 (CLSM) 觀察超聲初始溫度對玻璃表面阪崎腸桿菌生物膜脫落效果

圖8為激光共聚焦顯微鏡觀察SYTO9/PI染料對阪崎腸桿菌活死細胞染色變化直觀圖。圖8-a為空白對照組，即未經過超聲波處理組，都是綠色熒光，此時的阪崎腸桿菌最多。圖8-b為超聲波初始溫度為20 ℃時活細胞量，蓋玻片上的活細胞數量減少，圖8-c為超聲波初始溫度為30 ℃時的活細胞量，玻片上生物膜幾乎全部脫落。圖8-d為超聲波初始溫度為50 ℃時的細胞，黃色代表死菌與活菌的重疊部分，阪崎腸桿菌不耐高溫，當溫度達到50 ℃時，阪崎腸桿菌即會出現部分死亡現象。從而當超聲波初始溫度超過一定溫度時，溫度越高，去除的活菌數越少。

圖8 CLSM觀察超聲溫度對阪崎腸桿菌生物膜去除效果Fig.8 Laser scanning confocal microscopy of the elimination effect of the ultrasonic temperature on Cronobacter sakazakii biofilm注：a～d為超聲波處理的Cronobacter sakazakii biofilm經CLSM (63×/1.4油鏡)觀察圖。a為空白對照，未經超聲波處理；b、c、d為實驗組，超聲波初始溫度分別為20， 30，50 ℃。

2.4.4 激光共聚焦顯微鏡 (CLSM) 觀察超聲時間對玻璃表面阪崎腸桿菌生物膜脫落效果

圖9為激光共聚焦顯微鏡觀察SYTO9/PI染料對阪崎腸桿菌活死細胞染色變化直觀圖。圖9-a為空白對照組，即未經過超聲波處理組，可以清楚看到活細胞量很多。圖9-b為超聲波處理2 min后的活細胞量，可以看出玻片上活菌數量大幅度減少，表明超聲波對活菌具有去除作用。圖9-c為超聲波處理14 min后的活細胞量，玻片上活菌幾乎全部脫落。圖9-d為超聲波處理23 min后的細胞，黃色代表死菌與活菌的重疊部分，即出現了死細胞，這是因為處理時間過久，溫度過高，導致菌體損傷，所以脫落的活細胞量減少。

圖9 CLSM觀察超聲時間對阪崎腸桿菌生物膜去除效果Fig.9 Laser scanning confocal microscopy of the elimination effect of the ultrasonic time on Cronobacter sakazakii biofilm注：a～d為超聲波處理的Cronobacter sakazakii biofilm經CLSM(63×/1.4油鏡)觀察圖。a為空白對照，未經超聲波處理； b、c、d為實驗組，超聲波處理時間分別為2， 14，23 min。

3 結論

阪崎腸桿菌生物膜的形成受溫度、培養基pH值及培養基成分的影響。形成阪崎腸桿菌生物膜的最適生長溫度為37 ℃，最適培養基pH值為7.5。通過結晶紫染色法在倒置顯微鏡下可直接觀察阪崎腸桿菌生物膜量的變化情況。2.5%以內鹽度的培養基對生物膜形成有促進作用。加入適當的CaCl2和MgCl2均能提高生物膜量，CaCl2在質量分數為0.50%、MgCl2在質量分數為1.50%時能達到明顯的促進作用。加入Cu2+、EDTA對生物膜有抑制作用，質量分數越大，抑制能力越強。一定功率的超聲波能夠促進玻璃表面阪崎腸桿菌生物膜的脫落，其效果受超聲處理的溫度與時間影響。本試驗結果得到的最佳超聲初始溫度為30 ℃，最佳超聲時間為14 min。激光共聚焦可直接觀察到超聲溫度和超聲初始時間對玻璃表面阪崎腸桿菌生物膜去除效果的影響?；诔暡▽ΣＡП砻孚嫫槟c桿菌的去除作用效果，該法可用于輔助其他滅菌法對嬰兒玻璃制奶瓶，盛裝食品玻璃瓶等玻璃制品上的阪崎腸桿菌進行解離。