枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶基因在釀酒酵母中的表達和應用

張若蘭,劉慶國,王敏,汪琨，朱廷恒

(浙江工業大學 生物工程學院，浙江 杭州，310014)

堿性蛋白酶是指用于水解蛋白質或多肽并且在堿性環境下活力較高、穩定性較好的一類酶[1]，與酸性和中性蛋白酶相比具有作用范圍廣，水解能力強等優點。目前，堿性蛋白酶廣泛應用于蛋白質去除、食品制劑、皮革加工、醫藥和生物修復等方面[2-5]，大豆蛋白水解就是其中十分重要的一個方面。大豆蛋白的必需氨基酸含量豐富、組分齊全，與牛奶蛋白質的氨基酸組成相近，是最具營養的植物蛋白質[6]，但是大豆蛋白中的大部分蛋白如β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白和胰蛋白酶抑制因子都是致敏性蛋白[7]，影響了其作為食物的可接受性,并且大豆蛋白質的分子結構較為緊密，對酶解具有很強的抵抗力,不易被吸收, 使得其消化率和生物效價不及牛奶、蛋等動物性蛋白。為了使植物蛋白質成為優質蛋白養分更好的被利用吸收，在飼料和食品工業中，可添加堿性蛋白酶催化飼料中的大分子蛋白質降解為肽和氨基酸。釀酒酵母是用于飼料和食品生產的益生菌，目前利用釀酒酵母表達堿性蛋白酶的研究較少。枯草芽孢桿菌具有產蛋白酶量大、耐高溫等特點，從枯草芽孢桿菌中克隆堿性蛋白酶基因轉化進釀酒酵母中，獲得的產堿性蛋白酶酵母在食品和飼料生產中具有重要的現實意義。

我國的堿性蛋白酶研究存在微生物資源開發不足，種類較少，作用范圍較窄，酶制劑品種單一、價格昂貴等問題[8]。目前大多堿性蛋白酶研究重點集中在高產菌的篩選、酶的分離和純化及酶的應用等方面，而且大多是應用在洗滌和皮革等行業[9-12]。在食品和醫藥工業中，主要應用來自曲霉屬的堿性蛋白酶[13]，但是其發酵過程易受多種因素(如易污染或菌株生長狀態)影響。另外，米曲霉產生的蛋白酶種類較多，這增加了堿性蛋白酶的純化難度，阻礙了其進一步的開發利用[14]。

重組DNA技術和蛋白質工程具有大幅提高酶的產量，推出量身定制的功能特性，包括穩定性，催化活性和特異性，克服一些傳統菌種選育方法缺點等的優勢[15-18]。基于堿性蛋白酶在食品發酵行業的廣泛需求，利用基因工程技術挖掘安全、價格低廉、菌體易于培養、易于實現工業化生產的菌株是未來研究亟待解決的問題。

釀酒酵母在食品和醫藥等領域有廣泛應用，是一種典型的真核細胞模型和重要的模式生物[19]，可表達各種原核和真核來源的蛋白。釀酒酵母在飼料蛋白原料豆粕的發酵加工中是主要微生物，但是釀酒酵母幾乎沒有堿性蛋白酶活性，不能有效地去除豆粕中的抗原蛋白，本文將來自枯草芽孢桿菌的堿性蛋白酶基因克隆至釀酒酵母中構建工程菌，誘導表達目的蛋白，對其性質進行研究，為堿性蛋白酶在食品發酵工業的更廣泛應用提供依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

釀酒酵母Whu2d(尿嘧啶缺陷)、大腸桿菌(Escherichiacoli)(含有pYES2質粒)、E.coliDH 5α由本實驗室保存。

1.1.2 工具酶、試劑盒和試劑

rTaq聚合酶、限制性內切酶、DNA Marker和瓊脂糖凝膠回收試劑盒等均購自TaKaRa公司；卡那霉素、PCR產物純化試劑盒、小量DNA產物純化試劑盒、福林酚和酪蛋白等均購自上海生工生物工程有限公司；大豆胰蛋白酶抑制因子測定試劑盒、大豆球蛋白測定試劑盒、β-伴大豆球蛋白測定試劑盒等均購自北京龍科方舟生物工程技術有限公司， 其他試劑均為進口或國產。

1.1.3 實驗儀器

Biometra PCR儀、低溫離心機、MniniRUN Ge100型電泳槽、RH-150生化培養箱，上海一恒；YXQ-LS-50SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊；UV7504分光光度計、JIRCAS 3UV Transilluminator紫外投射儀和超聲波破碎儀等。

1.2 方法

1.2.1 編碼枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶重組基因的獲得及其表達載體的構建和鑒定

1.2.2 釀酒酵母菌工程菌的構建和驗證

將重組質粒pYES2-SAP通過醋酸鋰轉化法轉入釀酒酵母Whu2d中，轉化后分別涂布于YNB(URA3-)平板上，30 ℃培養2～4 d。挑取URA3+轉化子接到YNB(URA3-)液體培養基中，30 ℃培養16 h，用試劑盒提取酵母質粒。將獲得的質粒轉化E.coliDH5α進行擴增。挑取克隆子用引物進行PCR鑒定，F2: 5’- GAGGACCAAGAAGACATCA- 3’；R2: 5’- GTGGAGAAGCCATAGAGG - 3’，PCR擴增條件同上，產物經瓊脂糖電泳檢測，陽性酵母轉化子命名為 pYES2-SAP-Whu2d。

1.2.3 重組酵母菌株的誘導表達和堿性蛋白酶活力測定

挑取釀酒酵母轉化子接種于5 mL YNB(URA3-)液體培養基中，以28 ℃、200 r/min振蕩培養12 h，然后轉接到100 mL發酵培養基中。離心收集上清液，用福林酚法測定酶活，將0.025 mol/L硼酸-氫氧化鈉緩沖液(pH為10.5)配制的酪蛋白溶液，40 ℃預熱5 min。待測樣品1.00 mL，40 ℃水浴2 min；加酪蛋白溶液1.00 mL 40 ℃水浴10 min；加入2.0 mL濃度為0.4 mol/L的三氯乙酸，隨后以12 000 r/min離心10 min，取1.00 mL上清液加入5 mL濃度為0.40 mol/L的Na2CO3溶液和1 mL福林試劑，40 ℃保溫20 min，在680 nm下測定其OD值。40 ℃下1 mL反應混合物每分鐘催化產生1 μg 酪氨酸的酶量定義為1個活力單位(U)。收集發酵液進行SDS-PAGE分析。

1.2.4 溫度和pH對堿性蛋白酶活性和穩定性的影響

將粗酶液反應溫度設為30～60 ℃(梯度為5 ℃)探究堿性蛋白酶的最適反應溫度。在30～70 ℃(梯度為10 ℃)下處理粗酶液10～60 min 探究堿性蛋白酶的熱穩定性。將粗酶液反應pH值設為磷酸鹽-檸檬酸鈉(pH 7.0、7.2、7.6、8.0、9.0)、硼酸緩沖液(pH 10.5，pH 13.0)的不同pH值下探究堿性蛋白酶的最適反應pH。然后在4 ℃、pH值7.0～13.0條件下處理粗酶液12 h測定殘余角蛋白酶酶活。未受任何處理的酶活性定為100%，各種處理的酶活與之對比，計算出相對活性。

1.2.5 金屬離子和蛋白酶抑制劑對酶活性的影響

將50 mmol/L MgSO4、MnCl2、BaCl2、CuSO4、ZnCl2、FeSO4、CaCl2、LiAc、CoCl2溶液，添加到反應體系中探究金屬離子對酶活性的影響。在粗酶液中加入SDS、Tween60、Triton X-100、EDTANa2、β-巰基乙醇、PMSF等蛋白抑制劑4 ℃處理30 min，探究其對堿性蛋白酶活性的影響。

1.2.6 重組蛋白酶工程菌對豆粕中蛋白和抗營養因子的降解研究

將釀酒酵母工程菌于5 mL液體YNB試管培養基中，200 r/min，28 ℃，搖床培養14～16 h。接入10%的菌液量于固態發酵培養基中，28 ℃發酵48 h。用凱氏定氮法對發酵前后豆粕中的粗蛋白含量進行測定。用半微量法或全量法粗蛋白質測定方法測定發酵前后酸溶蛋白含量。用酶聯免疫法(ELISA)定量測定試劑盒測定發酵前后豆粕中抗營養因子β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子的含量。

2 結果與分析

2.1 編碼枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶重組基因的獲得及其表達載體的構建和鑒定

2.1.1 堿性蛋白酶成熟肽編碼基因 (SAP)的PCR擴增

含有堿性蛋白酶基因的pUC57-SAP質粒DNA為模板，以F1/R1為引物，PCR擴增得到1 181 bp源于枯草芽孢桿菌并經密碼子優化的堿性蛋白酶基因SAP。

2.1.2 重組表達質粒的構建和鑒定

將SAP基因DNA片段克隆到TA載體 pMD19，將重組質粒轉化到E.coliDH5α。用XhoⅠ、SphⅠ分別酶切表達質粒pYES2和pMD19-SAP，連接獲得pYES2-SAP重組表達質粒，將重組質粒轉化到E.coliDH5α中，使用含100 μg/mL 氨芐青霉素LB 平板培養基篩選得到陽性克隆。用限制性內切酶XhoⅠ、SphⅠ進行酶切驗證，得到大小為1 181 bp和5 787 bp 的條帶，酶切驗證正確 。

2.2 釀酒酵母菌工程菌的構建和驗證

將pYES2-SAP通過醋酸鋰轉化法轉入到釀酒酵母Whu2d轉化液涂布于YNB(URA3-)固體培養基上，隨機挑取轉化子提取酵母質粒，轉入E.coliDH5α中，以F2/R2 為引物進行PCR驗證。pYES2-SAP-Whu2d轉化子在975 bp處出現條帶，與理論值相符 。

2.3 重組酵母菌株的誘導表達

挑取17個陽性轉化子接種于YNB(URA3-)液體培養基，出發菌株接種于YPD液體培養基，培養16 h后，將所得菌體轉接到發酵培養基中，培養后對出發菌株和工程菌株上清液和胞內液粗酶活進行酶活測定。出發菌株與7號工程菌株的酶活有很大差異，對其進行顯著性分析，分析結果見圖1。結果顯示，兩者酶活存在顯著差異(p<0.01)，工程菌株比出發菌株的粗酶活高55.2%。證明SAP在釀酒酵母WHU2d中成功表達。收集上清液進行SDS-PAGE驗證,結果見圖2,根據氨基酸序列推導出來的堿性蛋白酶理論分子量是39.5 kDa，沒有看到目的蛋白的條帶，而通過酶活測定有酶活，證明堿性蛋白在釀酒酵母中表達了，但是表達量太少，通過SDS-PAGE看不出來。

圖1 酶活力顯著性差異Fig.1 The significance difference of enzyme activity* 代表差異的顯著性

M-maker;1-原始菌株; 2-空質粒菌株; 3-重組菌株圖2 SDS-PAGE分析堿性蛋白酶的表達Fig.2 The analysis of Alkaline protease by SDS-PAGE

2.4 堿性蛋白酶酶活性質分析

2.4.1 堿性蛋白酶最適反應溫度及溫度穩定性

由圖3-a可知，重組酶的最適溫度為45 ℃，溫度低于45 ℃時，酶活隨溫度上升而上升，當溫度高于45 ℃時，酶活迅速下降。將粗酶液置于30、40、50、60、70 ℃水浴中保溫20～60 min后，再與1%酪蛋白底物混合反應，測定酶活，結果如圖3-b。可以看出，在30 ℃和40 ℃保溫1 h后，剩余的酶活分別為97%和90%，表明該粗蛋白酶在溫度低于40 ℃時酶活是穩定的；當溫度在50～60 ℃之間時，蛋白酶活性有所降低，但酶活仍在70%左右；高于60℃時，酶活迅速下降，70 ℃保溫60 min后，相對酶活接近于0。

圖3 溫度對蛋白酶粗酶活的影響Fig.3 Effects of temperature on the protease activitye

2.4.2 堿性蛋白酶最適反應pH及pH穩定性

從圖4-a中可以看出，此蛋白酶從中性到堿性都有活性，在pH 8.0時，酶活達到最高。將粗酶液與不同pH的1%酪蛋白溶液混合后，4 ℃放置12 h，進行酶活測定，結果如圖4-b。可以看出，該蛋白酶從中性到到堿性(pH7.6～10.5)酶活力較穩定，而且相對酶活都在80%以上。只有pH在高于11或12時，酶活力才會明顯降低。因此確定該蛋白酶屬于堿性蛋白酶。

圖4 pH對蛋白酶粗酶活的影響Fig.4 Effects of pH on the protease activitye

2.4.3 金屬離子對堿性蛋白酶活性影響

將粗酶液與不同金屬離子溶液按比例混合，使得金屬離子的最終濃度為1 mmol/L和5 mmol/L，4 ℃放置30 min，測定酶活性，結果用相對酶活表示(反應中加去離子水的酶活為100%)，見圖5。其中Mg2+、Li+和Co2+對該粗酶液酶活基本沒有影響；當金屬離子為1 mmol/L時，Mn2+、Fe2+、Ca2+對酶活沒有明顯的影響，而Ba2+、Cu2+、Zn2+對酶活有一定的促進作用，但增加的幅度并不太大。當金屬離子為5 mmol/L時，Ba2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+對酶活同樣有促進作用，增加幅度略高于低濃度金屬離子。根據文獻得知微生物來源的堿性蛋白酶在一定濃度Mn2+存在時，Mn2+會提高堿性蛋白酶的活性，并能提高蛋白酶的溫度穩定性[20]，而當Mn2+的濃度為5 mmol/L時，對該蛋白酶酶活有明顯的促進作用(p<0.01)，與理論相符。

圖5 金屬離子對蛋白酶粗酶活的影響Fig.5 Effects of different metal-ion on stability of the protease* 代表差異的顯著性

2.4.4 蛋白抑制劑對堿性蛋白酶活性影響

將粗酶液與不同的蛋白抑制劑混合，達到相應的終濃度后，測定酶活性，得到的相對酶活如圖6。可以看出，EDTANa2和β-巰基乙醇(β-ME)對該蛋白酶的活性基本無影響；SDS是一種陰離子表面活性劑，1 mmol/L的SDS對該蛋白酶有一定的促進作用，當濃度是10 mmol/L時，酶活有所降低，但酶活仍在90%以上；當Tween 60濃度是1 mmol/L時，對蛋白酶活性基本無影響，而濃度是10 mmol/L時，酶活只有15%左右，對該蛋白酶酶活有明顯的抑制作用(p<0.01)；Triton X-100和PMSF對該蛋白酶的影響較大，在濃度是1 mmol/L和10 mmol/L時，相對酶活都下降很多。

圖6 蛋白抑制劑對蛋白酶粗酶活的影響Fig.6 Effects of chemical reagent on the protease activity* 代表差異的顯著性

2.5 重組蛋白酶工程菌對豆粕中蛋白和抗營養因子的降解研究

釀酒酵母工程菌株對豆粕進行固態誘導發酵48 h后，分別測定發酵前后豆粕樣品中的粗蛋白、酸溶蛋白和抗營養因子的含量變化。工程菌株在固態發酵后，對豆粕中粗蛋白的增加無明顯效果，卻可以顯著增加酸溶蛋白的含量(圖7-a，p<0.01)，與出發菌株相比增加42.1%；在消除抗營養因子方面，工程菌株去除β-伴大豆球蛋白的效果與出發菌株無顯著差異；而降解大豆球蛋白(圖7-b，p<0.05)和胰蛋白酶抑制因子與出發菌株存在顯著性差異(圖7-c，p<0.05)，降解能力分別比出發菌株提高41.9%和57.4%。

圖7 工程菌對豆粕中蛋白和抗營養因子的降解Fig.7 Degradation of proteins and anti-nutritional factors in soybean meal by engineering bacteria*代表差異的顯著性

3 討論

本文克隆了枯草芽孢桿菌來源的重組堿性蛋白酶基因并在釀酒酵母中成功誘導表達，對其酶學性質和豆粕中蛋白類抗營養因子的降解效果進行了研究。釀酒酵母的蛋白酶酶活很低，對豆粕中的大豆蛋白幾乎沒有分解能力。在本實驗中，釀酒酵母工程菌與釀酒酵母出發菌株相比，堿性蛋白酶酶活提高55.2%，分解大豆球蛋白和胰蛋白酶抑制因子能力分別提高41.9%和57.4%，分解大豆蛋白形成酸溶蛋白能力提高42.1%，這表明釀酒酵母工程菌在一定程度上可以解決大豆蛋白致敏作用強和利用率低的問題。并且獲得的堿性蛋白酶直接分泌到發酵液中，利于該酶的分離純化和工程菌發酵處理飼料蛋白原料。該酶具有較寬泛的pH穩定性和較高的熱穩定性，能較好的適應發酵生產過程中的pH和溫度變化。以上結果顯示該重組堿性蛋白酶在飼料、食品生產中有較大的應用潛力。