鈉型Amberlite IRC-50樹脂分離提取ε-聚賴氨酸的條件優化

何洪剛，李芳良，馬玉，陳旭升，毛忠貴

(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

ε-聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine，ε-PL)是一種由放線菌生產的次級代謝產物，由25～35個L-賴氨酸殘基通過α-羧基與ε-氨基縮合形成的同型氨基酸聚合物[1]，分子質量為3 200～4 500 Da。在中性和酸性水溶液環境中ε-PL呈現多聚陽離子體形式，可與微生物細胞表面相結合，對微生物細胞膜的結構造成損傷，導致微生物生長傳代受阻，甚至死亡[2]，從而達到抑菌作用。因此，目前ε-PL主要被用作一種天然、安全的食品防腐劑，在日本、韓國和美國的食品工業中得到廣泛應用。2014年，我國也正式批準ε-PL及其鹽酸鹽為新的食品添加劑品種[3]。

目前ε-PL的生產只能通過微生物發酵法實現。通過近20年不斷的菌種選育和發酵工藝優化，我國ε-PL發酵產量最高為54.7 g/L[4]，已達到工業化生產的要求。如何實現從發酵液中高效分離ε-PL越來越受到學術界和產業界的關注。由于ε-PL具有等電點高的特性(pI=9.0)，故采用陽離子交換樹脂吸附提取ε-PL就成為其從發酵液中進行分離的一種有效方法。近年來，許多研究者采用具有吸附容量大、易再生的大孔弱酸陽離子交換樹脂作為主要研究對象，用于ε-PL的分離和提取。劉潔萍[5]在弱酸陽離子樹脂D152靜態條件優化的基礎上確定了動態交換的條件，最終樹脂工作交換容量為77.81 g/L(濕樹脂)。莫樹平等[6]采用靜態實驗對弱酸陽離子樹脂D113的解吸條件做了系統優化，在最佳解吸條件下解吸率達到96.8%。宗紅等[7]通過靜態吸附法在3種樹脂中篩選出了適合ε-PL提取的弱酸陽離子樹脂HD-2，最終使ε-PL的回收率達到92.0%，樹脂靜態吸附量為8.34 mg/g濕樹脂。劉延嶺等[8]選用弱酸陽離子樹脂HD-2對超濾液進行離子交換，樹脂靜態吸附量為15.2 mg/g濕樹脂。朱瑪驍騏等[9]系統分析了弱酸陽離子交換樹脂HZD-3B和D155在分離發酵液中的ε-PL時的吸附等溫線和吸附動力學，通過優化該兩種樹脂的靜態吸附條件，最終靜態吸附量達到200 mg/g濕樹脂以上。上述研究中所采用的樹脂均為氫型弱酸陽離子樹脂，該類樹脂在離子交換過程中pH處于一直下降趨勢，從而降低了樹脂的選擇性和吸附量。另外，研究者僅研究了靜態條件下樹脂吸附ε-PL的條件，而忽略了靜態與動態實驗操作條件存在著明顯差異。

本研究團隊在前期大量樹脂篩選基礎上，獲得了一種適合ε-PL分離提取的大孔弱酸型離子交換樹脂Amberlite IRC-50。通過將該樹脂分別轉型成鈉型和氨型，比較了它們對ε-PL吸附與解吸的差異分析，確定了鈉型Amberlite IRC-50樹脂更有利于ε-PL的分離提取[10]。本論文重點考察了上樣料液pH值和上樣速度對鈉型Amberlite IRC-50吸附ε-PL的影響；并研究了不同洗滌條件對ε-PL純度影響，同時還考察了洗脫劑濃度和洗脫速度對ε-PL洗脫效果的影響。最后，評估了鈉型Amberlite IRC-50對ε-PL純度提升的貢獻。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發酵液由本實驗室提供，制備方法見文獻[11]；大孔弱酸離子交換樹脂Amberlite IRC-50，廣州佰默生物科技有限公司；ε-PL樣品(純度≥95%)，鄭州拜納佛生物工程股份有限公司；甲醇、乙腈：色譜純，美國TEDIA天地試劑公司；鹽酸、氫氧化鈉、氨水：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

3K15離心機，德國Sigma Inc.；Millipore切向流超濾系統，美國Millipore公司；Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀(HPLC)，美國Agilent 公司；BT100-1F四通道蠕動泵，保定蘭格恒流泵有限公司；30 mm×200 mm玻璃層析柱，泰興市三愛思實驗儀器廠；UV-2100分光光度計，尤尼可儀器有限公司；HYL-C組合搖床，太倉市強樂實驗設備有限公司；AR224CN分析天平，奧豪斯儀器有限公司；FE20 pH計，瑞士Mettler Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵液的預處理

將發酵液進行離心(離心力為10 800×g)15 min收集上清液，菌體加水洗滌后重復離心操作獲得上清液。將上清液合并后用超濾膜過濾，收集透過液用于后續分離提取實驗，為保證回收率在95%以上，期間多次加去離子水進行稀釋操作。最終獲得ε-PL質量濃度約為4 g/L的超濾液。

1.3.2 IRC-50樹脂的預處理

稱取一定質量的IRC-50樹脂(出廠類型為氫型)，先用去離子水洗滌樹脂以去除破損樹脂及雜質，再依次使用5倍體積1 mol/L的NaOH、HCl、NaOH溶液在搖床振蕩4 h，200 r/min。每次酸堿洗滌后均使用去離子水沖洗3～5次去除殘留在樹脂間的酸堿溶液。依照上述步驟完成樹脂的轉型。

1.3.3 分析方法

ε-PL質量濃度采用LTZHAKI檢測法[12]測定；ε-PL損失率計算公式為：

(1)

式中：C0和C1分別為經過處理前后料液中的ε-PL質量濃度,g/L，V0和V1為料液經過處理前后的體積,L。

蛋白質量濃度采用考馬斯亮藍法[13]測定；蛋白去除率計算公式為：

(2)

式中：P0和P1分別為經過處理前后料液中的蛋白質量濃度，g/L；V0和V1為料液經過處理前后的體積，L。

色度采用分光光度法測定。經前期研究發現，發酵液在425 nm處存在可見光最大吸收峰[14]；采用425 nm作為色度的檢測波長。待測液用去離子水稀釋，使其吸光值在0.2～0.6之間。色度值R為待測液在425 nm處的吸光值與其稀釋倍數的乘積。色素去除率計算公式為：

(3)

式中：R0和R1分別為料液經過處理前后的色度值；V0和V1為料液經過處理前后的體積,L。

1.3.4 最適動態離子交換條件的確定

1.3.4.1 動態上樣pH 的確定

分別量取63.6 mL(對應于氫型濕樹脂的質量為23.8 g)預處理好的IRC-50鈉型樹脂，濕法裝柱，樹脂床高徑比為3∶1。調節蠕動泵流速為2.12 mL/min(2 BV/h)，使用去離子水自上而下洗滌樹脂床至流出液pH在10.3以下。使用6 mol/L NaOH溶液調節超濾液pH為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5。采用2 BV/h上樣速度進行上樣，待使用德拉道夫檢測流出液出現微量磚紅色沉淀時停止上樣，并使用2～3倍柱體積的去離子水沖洗，記錄上樣體積。洗脫條件根據預實驗暫定為0.2 mol/L NaOH溶液以2 BV/h速度洗脫(此洗脫條件樹脂解吸率均在95%以上)，待使用德拉道夫檢測流出液時出現微量磚紅色沉淀時開始收集，磚紅色沉淀消失時停止收集。

樹脂工作交換容量[15]計算公式為：

(4)

式中，C0為超濾液原始ε-PL質量濃度,mg/mL；V0為上樣體積,mL；m為濕樹脂的質量,g。

IRC-50樹脂解吸率的計算公式為：

(5)

式中：C0為上樣液中的ε-PL質量濃度,g/L；Cr為洗脫液中的ε-PL質量濃度,g/L；V0為上樣體積,L，Vr為洗脫液體積,L。

1.3.4.2 動態上樣速度的確定

根據前期實驗確定最適上樣pH為7.0，使用6 mol/L NaOH溶液調節超濾液pH為7.0，調節蠕動泵流速為2、3、4、5、6、7 BV/h進行上樣，待使用德拉道夫檢測流出液時出現微量磚紅色沉淀時開始定時取樣，一個柱體積取一個樣，直到使用德拉道夫檢測流出液出現大量磚紅色沉淀時停止取樣，上樣過程結束。測定所取樣品的ε-PL質量濃度，根據到達穿透點(穿透點定義為流出液中ε-PL質量濃度達到上樣ε-PL質量濃度的5%)時的上樣體積計算樹脂吸附量。以不顯著降低樹脂吸附量的前提下最大限度節省上樣時間為指標，篩選出最適上樣速度用于后續實驗。

1.3.4.3 洗滌條件的確定

在最適上樣條件(上樣pH 7.0，上樣速度5 BV/h)下進行上樣，待使用德拉道夫檢測流出液時出現微量磚紅色沉淀時停止上樣。使用去離子水和不同濃度的氨水(0.02～0.05 mol/L)作為洗滌劑，洗滌速度為2 BV/h，洗滌時間為2 h。根據最終洗脫液的色素去除率、蛋白去除率及純度指標綜合評定洗滌結果，篩選出最適洗滌條件。

1.3.4.4 洗脫濃度的確定

在最適上樣條件下進行上樣，待使用德拉道夫檢測流出液時出現微量磚紅色沉淀時停止上樣，使用去離子水2 BV/h洗滌2 h。配制0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mol/L的NaOH 溶液作為洗脫劑，洗脫速度暫定為2 BV/h。為了使洗脫具有充足的時間，洗脫最長時間定為8 h。洗脫操作開始時記錄開始洗脫時間，待流出液使用德拉道夫檢測時出現微量磚紅色沉淀時開始收集，待檢測不到磚紅色沉淀時停止收集并記錄結束洗脫的時間；計算洗脫過程中洗脫劑的消耗量。根據洗脫所消耗的時間和洗脫劑的消耗量確定最適的洗脫濃度。

1.3.4.5 洗脫速度的確定

上樣、洗滌條件與確定洗脫濃度時所采用的條件一致，使用最適洗脫濃度的洗脫劑(0.25 mol/L NaOH溶液)，調節蠕動泵流速為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 BV/h進行洗脫。待流出液使用德拉道夫檢測時出現微量磚紅色沉淀時開始收集，待檢測不到磚紅色沉淀時停止收集；記錄洗脫總耗時，計算洗脫過程中洗脫劑的消耗量。以較少消耗洗脫劑的前提下最大幅度的節省洗脫時間為指標確定最適的洗脫速度。

1.3.5 HPLC法檢測實驗室提取的ε-PL純度及過程樣品的ε-PL色譜分析

ε-PL樣品純度采用HPLC檢測ε-PL法[16]測定。過程樣品用流動相稀釋4～10倍，再用0.45 μm微孔濾膜過濾，在檢測波長為215 nm條件下進行液相色譜分析。

2 結果與分析

2.1 上樣條件的優化

2.1.1 上樣pH對樹脂工作交換容量、蛋白及色素去除率的影響

如圖1所示，上樣pH在5.5～7.0范圍時，樹脂的工作交換容量隨pH升高而不斷增加，蛋白和色素的去除率也表現出緩慢增加趨勢。此階段隨著pH的升高，等電點在5.5～7.0的雜蛋白和色素會逐漸帶上負電而不被樹脂吸附，使原本吸附這些雜質的樹脂活性位點空余出來以吸附更多的ε-PL。在此pH范圍下，上樣pH越高，這種趨勢就越明顯，從圖中也可以看出上樣pH在7.0時達到樹脂的最大工作交換容量。上樣pH在7.0～8.5范圍時，樹脂工作交換容量呈現逐漸下降的趨勢，而蛋白及色素去除率仍呈現顯著增加的趨勢。由于該樹脂是大孔弱酸鈉型樹脂，其離子交換基團為—COONa，樹脂上的羧基存在電離平衡，會優先結合H+，從而使樹脂水溶液pH在10.3左右。ε-PL的等電點在9.0左右，隨著上樣pH的升高，在樹脂內部發生交換時的pH會越來越接近甚至超過ε-PL的等電點，從而使ε-PL的帶電性質發生變化，與樹脂的結合能力減弱，導致ε-PL不能被完全吸附而穿透，從圖上反映出工作交換容量呈下降趨勢。而一般雜蛋白的等電點為5～7[17]，當上樣pH超過9.0后，會使越來越多的雜蛋白和色素帶上負電而不被樹脂吸附，從而使這些雜質被去除。綜合考慮樹脂工作交換容量與雜質的去除效果，最適上樣pH為7.0。

圖1 pH對樹脂工作交換容量、蛋白及色素去除率的影響Fig.1 Effect of pH values on the working exchange capacity,deproteinization ratio and decolorization ratio of resin

2.1.2 上樣速度對樹脂工作交換容量的影響

由圖2可知，隨著上樣速度的增加，樹脂工作交換容量逐漸降低，特別是上樣速度超過5 BV/h后，下降趨勢更加明顯。離子交換過程中擴散是主要的限速步驟，而擴散又分為內部擴散和外部擴散。當樹脂在低流速的條件下吸附低濃度目的產物時，主要是外部擴散為限速步驟[18]。本實驗所使用的料液中ε-PL質量濃度較低(約為4 g/L)，在較低的上樣速度(2 BV/h)時，外部擴散為限速步驟。因此，適當的提高上樣速度并不會降低樹脂吸附ε-PL的能力，從圖中也可以看出上樣速度由2 BV/h 提升至5 BV/h 時樹脂工作交換容量只有略微的降低。但是當上樣速度繼續提升(由5 BV/h 提升至7 BV/h)時，ε-PL來不及吸附到樹脂表面，從而使流出液中ε-PL質量濃度提前達到穿透點，導致樹脂工作交換容量的下降。為了提高樹脂吸附效率，要在不顯著降低樹脂工作交換容量的前提下盡可能的縮短上樣時間。因此，最適上樣速度應為 5 BV/h，此時樹脂的工作交換容量為305.12 mg/g(以濕樹脂質量計算)。

圖2 上樣速度對樹脂工作交換容量的影響Fig.2 Effect of flow rate on working exchange capacity of resin

2.2 洗滌條件的優化

表1 洗滌劑濃度對洗脫液蛋白、色素去除率及純度的影響Table 1 Effect of detergent concentration on the removalrate of protein, pigment removal rate and purity of eluate

注：空白對照的洗滌劑為去離子水

由表1可知，使用去離子水與使用不同濃度氨水洗滌時，蛋白及色素的去除率相差不大；就純度而言，由于未對洗脫液進行脫鹽，所得純度只能作為參考，純度變化不顯著?？傮w來看實驗中所采用的洗滌劑效果基本一致，蛋白去除率和純度均在70%以上，色素去除率均在60%以上。考慮到后期脫鹽，最終選擇以去離子水作為洗滌劑進行后續實驗。

2.3 洗脫條件的優化

2.3.1 洗脫劑濃度對ε-PL解吸的影響

由于解吸率與洗脫時間有關，為了保證解吸完全，最長洗脫時間定為8 h。實驗結果見表2。由表2可知，0.05 mol/L和0.1 mol/L的NaOH溶液對樹脂的解吸率均不到90%，表明在規定洗脫時間內此范圍的洗脫劑濃度不能使吸附ε-PL的樹脂完全解吸。NaOH溶液濃度超過0.15 mol/L時，樹脂解吸率均在95%以上，表明該樹脂解吸性能良好；從表中可以看出洗脫劑濃度越大，洗脫時間越短，對應洗脫劑消耗量也越大。洗脫主要是將吸附到樹脂內部的ε-PL釋放到樹脂外部，內部擴散為限速步驟，而擴散速度與擴散界面兩側的濃度差成正比[19]，所以樹脂外部NaOH溶液濃度越高，越有利于ε-PL的擴散，從而減少洗脫時間。當NaOH溶液濃度過高時會使部分鈉離子來不及結合到樹脂上而導致NaOH利用率的降低，從而使NaOH的消耗量升高。為了降低后期脫鹽的壓力，洗脫劑濃度不能設置過高，但低濃度的洗脫劑會使洗脫時間過長從而影響后續的處理工藝。綜合考慮洗脫時間、NaOH消耗量及后續脫鹽，0.25 mol/L的NaOH為最適洗脫濃度。

表2 洗脫劑濃度對樹脂解吸效率的影響Table 2 Effect of eluant concentration on desorptionefficiency of resin

2.3.2 洗脫劑流速對ε-PL解吸的影響

不同的洗脫流速下，樹脂解吸率均達到95%以上。隨著洗脫速度的增加，洗脫時間和濃縮比逐漸減少，而洗脫劑的消耗量逐漸增加。在0.25 mol/L NaOH溶液作為洗脫劑的條件下，外部擴散為洗脫的主要限制條件，洗脫流速主要影響外部擴散速度，在一定的范圍內，增加洗脫速度會減少洗脫耗時，從而提高洗脫效率。但是隨著洗脫速度的不斷提升，會造成洗脫劑用量增加，并且濃縮效應也會降低。綜合考慮洗脫時間、濃縮比和洗脫劑消耗量，2 BV/h為最適洗脫速度。

表3 洗脫流速對樹脂解吸效率的影響Table 3 Effect of elution rate on desorption efficiencyof resin

2.4 鈉型Amberlite IRC-50樹脂分離ε-PL過程

2.4.1 最優條件下鈉型Amberlite IRC-50樹脂上樣-洗滌-洗脫曲線

圖3為鈉型Amberlite IRC-50樹脂在吸附ε-PL過程中的吸附穿透曲線，由于該樹脂可交換離子為Na+，在交換過程中不會引起pH的大幅度變化。上樣流出液pH穩定在8～9之間，此pH條件下弱酸樹脂的交換基團充分解離，ε-PL帶正電從而被樹脂吸附。在52個柱體積的交換過程中，流出液中的色素和蛋白濃度保持穩定，流出液中沒有檢測到ε-PL，表明樹脂在上樣過程中交換性能保持穩定。pH是影響離子交換的關鍵因素，只有保證交換過程中pH的穩定，弱酸樹脂的吸附選擇性才不會受到影響。52個柱體積之后，即將達到樹脂的工作交換容量，從而在流出液中檢測到有ε-PL穿透，當ε-PL穿透濃度達到上樣濃度的5%時整個上樣過程結束。

圖3 IRC-50 鈉型樹脂吸附穿透曲線Fig.3 Adsorption breakthrough curve of IRC-50 in the forms of Na+

采用洗滌劑為去離子水，洗滌體積為4 BV；洗滌速度與洗脫速度一致，均為2 BV/h。如圖4所示，在洗滌過程中，pH呈現上升的趨勢，這主要是由于弱酸樹脂的性質引起的；色度呈現降低的趨勢，隨著洗滌的進行，樹脂床中殘留的料液被去離子取代，從而引起流出液色度的降低；蛋白濃度呈現略微上升，表明可以通過洗滌使結合到樹脂上的部分蛋白解吸，從而去除該部分蛋白。在洗脫過程中，在起始階段流出液中沒有檢測到ε-PL，但蛋白濃度和色度明顯增大，表明ε-PL與樹脂的結合能力要大于蛋白和色素雜質，使得在洗脫過程中，蛋白和色素被優先解吸。隨著洗脫的進行，蛋白濃度逐漸降低；色度的變化情況與ε-PL濃度類似，ε-PL本身具有顏色，這可能是導致這一現象的原因；隨著ε-PL濃度的升高，pH變化不大，這是由于ε-PL具有大量的胺基，會結合氫氧根，導致pH沒有明顯的上升，隨著洗脫的繼續，之前結合到樹脂的ε-PL大量被解吸，從而無法充分的結合洗脫劑中的氫氧根，導致洗脫液pH的升高；在洗脫將要結束時，樹脂上吸附的物質都被解吸下來，洗脫液液中大部分為洗脫劑(0.25 M的NaOH溶液)。

圖4 IRC-50 鈉型樹脂洗滌與洗脫曲線Fig.4 Washing and elution curves of IRC-50 in the forms of Na+

2.4.2 離子交換單元雜質去除情況及收率純度分析

圖5為離子交換前后料液在215 nm處的液相色譜圖，第1個峰為ε-PL的峰，其余峰均為雜質。從圖中可以明顯看出，經過離子交換處理后，雜峰的個數明顯減少，僅剩余2個雜質峰。對比離子交換之前，這2個雜峰的高度也明顯降低。因此推測在pH 為7.0的超濾液中雜質主要為不帶電或帶負電的物質，在離子交換過程中不被陽離子樹脂吸附，從而得以去除。C圖為ε-PL樣品的液相圖譜，對比標準液相圖譜發現，經過離子交換的料液ε-PL的峰與標準圖譜非常一致，表明經過離子交換沒有使ε-PL成分受到破壞。經過離子交換后，大部分雜質被去除，純度由24.29%提升至75.26%，此時料液中主要雜質為無機離子(Na+等)。經過前期離子交換條件的優化，離子交換步驟的損失率較低，最終離子交換步驟的收率為96.40%。將此洗脫液進行脫色及納濾脫鹽等操作，最終獲得純度在95%以上，收率在60%以上的ε-PL鹽酸鹽樣品。

圖5 超濾液、樹脂洗脫液及ε-PL商品的液相色譜圖Fig.5 The chromatograms of ultrafiltrate, ion exchanging eluate and the product of ε-PL注：A、B、C分別表示超濾液、離子交換洗脫液及ε-PL商品

3 結論

通過對IRC-50鈉型樹脂分離發酵液中ε-PL動態條件的優化，使樹脂具有更好的分離效果。動態最適條件為：上樣pH為7.0、上樣速度為5 BV/h、洗滌劑為去離子水、洗滌速度為2 BV/h，洗脫劑為0.25 mol/L的NaOH溶液、洗脫速度為2 BV/h。在此離子交換條件下，樹脂工作交換容量為305.12 mg/g(以濕樹脂質量計算)，樹脂解吸率在95%以上；ε-PL純度由24.29%提升至75.26%，ε-PL回收率為96.40%。結合后續工序處理，最終獲得ε-PL總收率在60%以上，各項指標符合國家標準規定的ε-PL鹽酸鹽樣品。