植物乳桿菌dy-1發酵草菇泡菜工藝研究

王強，孫鑫娟，程珂，肖香，董英

(江蘇大學 食品與生物工程學院，江蘇 鎮江，212013)

草菇[Volvariellavolvacea(Bull.exFr.)Sing.]別名南華菇、美味苞腳菇、蘭花菇、麻菇及中國菇等，主要分布于熱帶和亞熱帶地區[1]，是典型的高溫型食用菌。草菇肉質肥嫩，味道鮮美，并富含蛋白質、氨基酸、VC及磷、鉀、鈣等多種營養物質，經常食用具有降低膽固醇和預防高血壓、冠心病的作用[2-4]。

我國草菇的食用方式一直以鮮食為主，但草菇后熟作用強烈，采摘后極易出現褐變、老熟、軟化及自溶液化腐敗等現象[5]。盡管朱東紅等[6]和JIA等[7]學者對草菇保鮮進行了許多研究，但產業化應用還有一定難度。NOVIANTI 等[8]對草菇進行真空冷凍干燥后雖易于貯藏，便于流通，但由于其能耗多，價格高，仍難以完全解決草菇供求之間的矛盾。

本研究以草菇為原料，采用植物乳桿菌dy-1(Lactobacillusplantarumdy-1)為發酵菌株，建立直投式乳酸菌發酵草菇泡菜工藝，并以自然發酵作為對照進行對比分析。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與菌種

草菇：江蘇江南生物科技有限公司提供；食鹽和蔗糖(食用級)：購于超市；檸檬酸(食用級)：購于江蘇國信協聯能源有限公司；氯化鈣(食用級)：購于江蘇科倫多食品配料有限公司。

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarumdy-1；菌株編號：CGMCCNo.601)：由江蘇大學食品營養與安全實驗室自行分離與制備。

1.2 培養基與試劑

乳酸菌活化與技術培養基：MRS培養基。

NaOH:分析純，國藥集團化學試劑有限公司；酚酞：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 儀器與設備

電子天平，上海精科天平儀器廠；電磁爐，九陽股份有限公司；TA-XT2i質構分析儀，英國Stable Micro System有限公司；YTC-2000型打孔器，江蘇省江都市麾村醫教儀器廠；Color Quest XE型分光測色儀，美國Hunter Lab公司；PHS-3TC型酸度計，上海天達儀器有限公司；SPX-250B-G型微電腦光照培養箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；全自動滅菌鍋，上海三申醫療器械有限公司；無菌操作臺，蘇州凈化設備有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌種活化

將保藏的植物乳桿菌dy-1的菌種按1∶10體積比接種于液體MRS培養基中，置于36 ℃恒溫培養箱中進行10 h的第1次活化，將第1次活化菌液按1∶5體積比接種于液體MRS培養基中，置于36 ℃恒溫培養箱中進行14 h的第2次活化后備用。

1.4.2 草菇泡菜發酵工藝流程

1.4.3 草菇泡菜燙漂工藝條件的優化

選擇檸檬酸質量濃度(1、2、3 g/L)、CaCl2質量濃度(6、8、10 g/L)、食鹽質量濃度(8、10、12 g/L)、燙漂時間(5、7、9 min)進行L9(34)正交試驗，取樣測定草菇脆度和色差，確定燙漂的最佳工藝參數。

1.4.4 草菇泡菜發酵工藝優化

1.4.4.1 食鹽質量濃度選擇

分別添加20、30、40、50、60 g/L的食鹽，在植物乳桿菌接種量為5%，蔗糖添加量為20 g/L，置于23 ℃培養箱中發酵5 d，并對發酵草菇進行總酸含量測定及感官評價，研究食鹽質量濃度對草菇泡菜發酵產酸和感官評價的影響。

1.4.4.2 蔗糖質量濃度選擇

分別添加0、10、20、30、40 g/L的蔗糖，在植物乳桿菌接種量為5%，食鹽添加量為40 g/L，置于23 ℃培養箱中發酵5 d，并對發酵草菇進行總酸含量測定及感官評價，研究蔗糖質量濃度對草菇泡菜發酵產酸和感官評價的影響。

1.4.4.3 植物乳桿菌接種量選擇

分別接種2%、3%、4%、5%、6%的植物乳桿菌，在食鹽添加量為40 g/L，蔗糖添加量為20 g/L，置于23 ℃培養箱中發酵5 d，并對發酵草菇進行總酸含量測定及感官評價，研究植物乳桿菌接種量對草菇泡菜發酵產酸和感官評價的影響。

1.4.4.4 發酵溫度選擇

按照草菇泡菜發酵工藝流程，在食鹽質量濃度為40 g/L，蔗糖質量濃度為20 g/L，植物乳桿菌接種量為5%的條件下，分別在溫度為15、19、23、27、31 ℃的培養箱發酵5 d，并對發酵草菇進行總酸含量測定及感官評價，研究發酵溫度對草菇泡菜發酵產酸和感官評價的影響。

1.4.4.5 TPA測定方法

參照文獻[9]的方法制備樣品：草菇經打孔器、制取φ1 cm×1 cm的圓柱體；探頭選用：平板圓柱探頭(φ25 mm)；試驗參數設定：測試速率、測后速率均設定為1.0 mm/s，壓縮量1.5 mm，2次壓縮間隔時間3 s。

1.4.5 草菇泡菜發酵工藝正交試驗設計

選取食鹽質量濃度(A)、蔗糖質量濃度(B)、植物乳桿菌接種量(C)、發酵溫度(D)單因素中較優的發酵條件設計正交試驗因素水平表，在此基礎上，以總酸和感官評分作為評定指標，采取L9(34)正交試驗來確定最優的發酵工藝。采用多指標正交試驗的變異系數分析方法對總酸和感官評分2個指標進行計算得出綜合評定值。

1.4.6 優化直投發酵工藝與自然發酵草菇泡菜品質比較

按照上述正交試驗得出的草菇泡菜最佳發酵工藝參數，以自然發酵為對照，比較其草菇泡菜理化、微生物和感官指標差異。

1.4.7 理化指標和微生物指標的測定

pH值的測定：采用精密pH計直接測定?？偹岬臏y定：參照GB/T 12456—2008采用酸堿中和滴定法測定。亞硝酸鹽測定：參照GB 5009.33—2010 采用鹽酸萘乙二胺法測定。菌落總數計數：參照GB 4789.2—2010 方法測定。乳酸菌數計數：參照GB 4789.35—2016 方法測定。酵母菌和霉菌計數：參照GB 4789.15—2010方法測定。大腸菌群計數：參照GB/T 4789.38—2008方法測定。

1.4.8 感官評價方法

將成熟草菇泡菜(含酸量0.5%～0.8%為成熟標準)樣品放置在一次性紙盤中，邀請10名經過專業感官評價訓練的評審員組成評定小組對泡菜的色澤、氣味、滋味、質地進行感官評定[10-11]，評價標準見表1。

表1 草菇泡菜感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standard of Volvariella volvacea pickles

1.4.9 數據處理

采用Excle 2010統計處理數據制作表格，OriginPro 9.0作圖。應用SPSS 22.0軟件對數據進行方差分析和顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 草菇泡菜燙漂工藝條件的優化

如表2所示，影響草菇泡菜燙漂工藝因素的順序為：檸檬酸質量濃度>氯化鈣質量濃度>食鹽質量濃度>燙漂時間。對燙漂工藝過程的綜合評定主要是針對燙漂后草菇的硬度和色差2個指標，參照胡慶國[12]方法按各指標權重系數與各指標試驗測試值的隸屬函數值乘積作為最終綜合評定值。其中氯化鈣質量濃度、食鹽質量濃度和燙漂時間為顯著性因素，檸檬酸質量濃度為極顯著性因素。燙漂時加入氯化鈣和檸檬酸可以改善產品質地，提高產品的脆性、彈性和咀嚼性，保持其自然色澤[13-15]，根據各因素對燙漂后草菇硬度和色澤的影響結果，確定草菇燙漂的工藝參數為：檸檬酸2 g/L，氯化鈣6 g/L，食鹽10 g/L，燙漂時間9 min。

表2 草菇泡菜燙漂工藝正交試驗結果Table 2 The orthogonal experiment result of blanching process

2.2 食鹽質量濃度對產酸量和感官評價的影響

圖1 食鹽質量濃度對草菇發酵產酸量的影響Fig.1 The change of Volvariella volvacea pickles total acid at different salty concentration

食鹽添加量會影響發酵過程中微生物的生長代謝及泡菜口味，從而影響泡菜風味[16]。由圖1和表3可知，隨著食鹽質量濃度的增大，總酸含量逐漸降低，主要是由于滲透壓的原因，植物乳桿菌的生長受到抑制，草菇泡菜發酵速度減慢，成熟時間延長。在20～40 g/L的食鹽質量濃度下，發酵所對應的泡菜總酸差異不顯著(p>0.05)，50 g/L的食鹽已經開始影響泡菜產酸量，經過顯著性分析，在發酵5 d時，其感官評價結果(82.8分)差異顯著(p<0.05)。較低質量濃度食鹽條件下草菇泡菜的氣味和滋味較差，可能是由于草菇泡菜酸味較重，咸味不足。而食鹽質量濃度過高，泡菜咸味太重，影響口感。在食鹽添加量為40 g/L時，草菇泡菜總酸含量為0.78 g/100 g，感官評分最高為86.2分，因此，選擇食鹽40 g/L為最佳。

表3 不同食鹽質量濃度下草菇泡菜感官評分Table 3 The score of Volvariella volvacea pickles sensory quality at different salty concentration

注：同一列的不同字母表示在p<0.05水平差異顯著。

2.3 蔗糖濃度對產酸量和感官評價的影響

圖2 蔗糖質量濃度對草菇發酵產酸量的影響Fig.2 The change of Volvariella volvacea pickles total acid at different sucrose concentration

由圖2可見，蔗糖作為植物乳桿菌的碳源，在發酵的起始階段可有效促進植物乳桿菌的生長，并隨著蔗糖質量濃度的增大，總酸含量增加，成熟時間縮短。蔗糖添加量在30 g/L和40 g/L時，在第2天已達到成熟(總酸含量0.59 g/100g和0.62 g/100g)，在泡菜生產過程中加入適量蔗糖，可以提高發酵速度，縮短生產周期。在發酵后期，隨著發酵速度減慢，添加蔗糖組泡菜總酸含量差異不顯著(p>0.05)。

由表4可知，當蔗糖添加量為40 g/L時，其感官評分較低，為78.2分，這是因為蔗糖添加量較大時，泡菜過甜而掩蓋了其他風味物質，使其香氣和滋味較差，并且其泡菜水也較粘稠。在蔗糖添加量為20 g/L時，草菇泡菜感官評分最高為84.3分，此時草菇泡菜總酸含量為0.85 g/100 g。因此，結合草菇泡菜總酸和評價指標，添加20 g/L的蔗糖為最佳。

表4 不同蔗糖質量濃度下草菇泡菜感官評分Table 4 The score of Volvariella volvacea pickles sensory quality at different sucrose concentration

注：同一列的不同字母表示在p<0.05水平差異顯著。

2.4 乳酸菌接種量對產酸量和感官評價的影響

由圖3可知，植物乳桿菌接種量對泡菜總酸有很大影響，在發酵前期，產酸量與接種量成正相關。在發酵5 d后，接種量為5%的條件下草菇泡菜總酸含量最高為0.90 g/100 g，接種量6%時草菇泡菜總酸含量則有所降低，主要源于乳酸菌添加量過多時，其自身生長需要消耗大量的糖，卻減少了乳酸的生成[17]。

由表5對草菇泡菜感官評分可知，在乳酸菌接種量為5%時，草菇泡菜評分最高為80.3分，與乳酸菌接種量在4%時感官評分(79.0分)差異不顯著(p>0.05)，乳酸菌接種量太高會造成泡菜香氣與滋味較差，從而影響泡菜的感官品質[18]。因此，選擇4%乳酸菌接種量較為合適。

圖3 植物乳桿菌接種量對草菇發酵產酸量的影響Fig.3 The change of Volvariella volvacea pickles total acid at different inoculation amount of Lactobacillus plantarum

菌接種量/%色澤(20分)氣味(20分)滋味(30分)質地(30分)總分214.4±0.71a12.5±0.85a22.9±0.57b24.2±0.63a74.0±0.94a315.6±0.97bc13.2±1.32a23.8±0.63c24.1±0.74a76.7±2.67b415.3±0.95abc14.8±0.92b24.0±0.67c24.9±0.54b79.0±1.83c516.0±1.25c14.9±0.57b24.4±0.52c25.0±0.67b80.3±1.64c615.0±0.82ab14.2±0.92b22.3±0.82a24.4±0.84ab75.9±1.29b

注：同一列的不同字母表示在p<0.05水平差異顯著。

2.5 發酵溫度對產酸量和感官評價的影響

由圖4和表6可知，隨著溫度的升高，乳酸菌生長代謝加快，產酸量較高，在27和31 ℃下發酵時，泡菜總酸在2 d時就接近0.5 g/100 g，達到成熟。但溫度較高條件下泡菜感官評分較低，可能是乳酸菌產酸較快，酸味太重，香氣不濃，滋味較差[19]。在15和19 ℃條件下，乳酸菌活性受到抑制，生長緩慢，不利于總酸的生成。發酵草菇泡菜的感官評分隨著溫度的升高呈現先升高后降低的趨勢， 23 ℃時感官評分最高為81.9分，但在23 ℃(總酸含量0.68 g/100 g)與31 ℃(總酸含量0.70 g/100 g)溫度范圍內發酵草菇泡菜的總酸含量差異并不顯著(p>0.05)。綜合草菇泡菜總酸和感官評價指標，本研究發酵溫度可選擇23 ℃。

圖4 發酵溫度對草菇發酵產酸量的影響Fig.4 The change of Volvariella volvacea pickles total acid at different temperature

發酵溫度/℃色澤(20分)氣味(20分)滋味(30分)質地(30分)總分1514.4±0.97a13.2±0.79a22.9±0.88a23.2±0.79ab73.7±1.77a1914.9±0.74a13.6±0.84a24.5±0.85b23.8±0.63bc76.8±1.69b2316.5±0.85b15.1±0.88b25.6±0.73c24.7±1.16c81.9±1.45c2714.8±0.92a15.2±1.23b24.3±0.82b23.9±0.99bc78.2±1.62b3114.6±1.07a13.4±0.52a22.4±1.26a22.6±1.17a73.0±1.33a

注：同一列的不同字母表示在p<0.05水平差異顯著。

2.6 正交試驗結果與分析

通過上述單因素試驗初步確定了各因素的最佳濃度，選取食鹽質量濃度、蔗糖質量濃度、乳酸菌接種量和發酵溫度作為正交試驗的4個因素，采用L9(34)正交表進行優化，正交實驗結果與分析見表7。影響草菇泡菜的因素順序為：B>A>D>C，各因素最佳組合為A2B3C1D2。在該組合的工藝條件下，草菇泡菜的總酸為0.83 g/100 g，感官評分為87分，故確定草菇泡菜的最佳發酵工藝為：食鹽40 g/L，蔗糖30 g/L，乳酸菌接種量4%，發酵溫度23 ℃。方差分析結果表明蔗糖質量濃度對草菇泡菜的發酵有極其顯著的影響(p<0.01)，食鹽質量濃度和發酵溫度對其有顯著影響(p<0.05)。

表7 草菇泡菜發酵工藝優化正交試驗結果Table 7 The orthogonal experiment results of fermentation Volvariella volvacea

2.7 植物乳桿菌發酵和自然發酵泡菜成品品質比較

由表8可知，植物乳桿菌直投發酵草菇泡菜發酵成熟周期比自然發酵較短，其亞硝酸鹽含量明顯低于自然發酵的草菇泡菜(p<0.05)，且遠低于GB 2762—2017中亞硝酸鹽含量的限量(20 mg/kg)，說明植物乳桿菌可以抑制亞硝酸鹽的生成；植物乳桿菌直投發酵的草菇泡菜成品中霉菌 <10 CFU/g，大腸菌群 <30 CFU/g，符合GB 2714—2015的限量，而自然發酵草菇泡菜成品中霉菌和大腸菌群均超過國家食品安全標準的限量。由于在自然發酵中容易滋生雜菌，泡菜成熟后氣味和滋味較差，其感官評分明顯低于植物乳桿菌直投式發酵。

表8 植物乳桿菌發酵和自然發酵泡菜成品理化、微生物和感官指標Table 8 Physicochemical and microbial index, sensoryevaluation of Volvariella volvacea pickles with Lactobacillusplantarum and natural fermentation

注：同一列的不同字母表示在p<0.05水平差異顯著。

3 結論

草菇中加入2 g/L的檸檬酸，6 g/L的氯化鈣，10 g/L的食鹽作為護色劑和保脆劑，時間為9 min的燙漂預處理可有效抑制草菇褐變，保持較好的色澤和脆度。在選定的試驗參數范圍內，食鹽質量濃度，蔗糖質量濃度，植物乳桿菌接種量和發酵溫度均對草菇泡菜發酵品質有影響，其中以蔗糖質量濃度對發酵草菇泡菜影響最大，其次為食鹽質量濃度和發酵溫度，乳酸菌接種量影響最小。草菇泡菜發酵的最佳工藝參數為：食鹽質量濃度40 g/L，蔗糖添加量20 g/L，植物乳桿菌接種量4%，發酵溫度23 ℃。由植物乳桿菌直投發酵制備的草菇泡菜中乳酸菌含量高于自然發酵，其霉菌數、大腸菌群數量和亞硝酸鹽含量均遠低于自然發酵，符合相關國標，食用更加安全，且成熟時間和感官品質均優于自然發酵，泡菜風味更加濃郁純正。乳酸菌直投發酵草菇泡菜不僅能促進草菇深加工產業的發展，緩解草菇保鮮期短的壓力，同時也為食用菌方便食品的開發提供新思路。