玉米醇溶蛋白-阿拉伯膠納米顆粒的制備及性質表征

許雪兒，李娟，陳正行*，王濤，王韌，王莉，羅小虎

1(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)2 (江南大學 糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫，214122)

我國玉米年產量高達2.153億t，其中近兩成用于制備玉米淀粉，在淀粉提取過程中所得分離產物玉米蛋白因其蛋白質組成不符合人體必需氨基酸組成需求而不被利用，其中玉米醇溶蛋白(zein)占據60%[1]。zein作為生物大分子其疏水氨基酸含量較高，溶于35%～90%乙醇而不溶于水和無水乙醇，利用zein特有的兩親性和獨特溶解性，能夠有效制備納米顆粒，但因穩定性較差，影響了應用[2]。阿拉伯膠(arabic gum，AG)是一種天然陰離子多糖，其結構上帶有部分蛋白物質及鼠李糖，若能通過靜電相互作用與zein有效結合，則可提高zein在水中的溶解性，并提高對酸堿鹽的耐受性[3]。生育酚(tocopherol，TOC)作為抗氧化性很強的功能性營養物質因其不穩定性限制了在人體內的有效輸送，通過制備所得zein-AG納米顆粒對TOC進行高效負載，達到緩釋效果[4]。制備zein納米顆粒時在親水膠體的選擇上前人多選擇果膠等進行研究，王麗娟等[5]研究果膠復合zein并負載姜黃素，結果表明果膠的加入有利于提高納米顆粒的穩定性和姜黃素的抗氧化性，但對于AG的研究甚少，且未見有關于不同zein初始儲備液濃度、不同醇水比對形成納米顆粒的影響的研究報道，而在實際制備中，以上都是極為重要的影響因素。石燕等[6]研究AG復合乳清蛋白制備微膠囊壁材，制得的壁材在穩定性和韌性等方面均高于單純的乳清蛋白壁材。

本文通過反溶劑法結合AG制備負載TOC的zein納米顆粒，研究zein儲備液質量濃度、體系中乙醇與水體積比(醇水比)、pH值、鹽離子濃度對納米顆粒穩定性影響，并對負載TOC的比例和包封率進行了探究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米醇溶蛋白，河南華瑞生物科技有限公司；阿拉伯膠、α-生育酚，美國Sigma試劑公司；AR級NaOH、HCl、無水乙醇、石油醚,上海國藥集團。

1.2 儀器與設備

磁力攪拌器，德國IKA儀器有限公司；Himac CR21G型冷凍干燥機，日本 HITACHI 公司； Zetasizer Nano ZS納米粒度電位儀，英國Marlven儀器公司；WFZ UV-2000型紫外可見光分光光度計，尤尼柯上海儀器有限公司；LXJ-IIB型低速臺式離心機，中國上海安亭科學儀器廠；DHG-9101·3SA型電熱恒溫鼓風干燥箱，中國上海三發科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 納米顆粒制備

稱取0.5 g zein溶解于10 mL體積分數為80%的乙醇中，磁力攪拌30 min作為zein儲備液；稱取2 g AG溶解于10 mL去離子水中，磁力攪拌1 h得到AG儲備液；量取800 μL zein儲備液呈細流狀移至38.9 mL的去離子水中，隨后移取300 μL AG儲備液至去離子水中(zein與AG質量比為1∶1.5，前期實驗所得最優比例)，磁力攪拌60 min后4 000 /min離心10 min后取上清液得zein-AG納米顆粒[7]。

1.3.2 不同zein儲備液濃度下納米顆粒粒徑、電位、多分散指數(polydispersity index，PDI)測定

分別稱取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 、0.6、0.7 g zein溶解于10 mL體積分數為80%乙醇中，磁力攪拌30 min作為質量濃度為10、20、30、40、50、60、70 g/L(質量濃度)的zein儲備液，隨后按照zein與AG質量比為1∶1.5加入zein、AG并調節納米顆粒pH=4，其他步驟同1.3.1；所得納米顆粒稀釋至10倍，分散均勻后取1 mL放入樣品池后進行測定[8]。

1.3.3 不同醇水比下納米顆粒粒徑、電位、PDI測定

取不同體積zein的乙醇儲備液與樣品中水體積比為1∶50、1∶40、1∶30、1∶20、1∶10、1∶5，調節并固定納米顆粒pH=4，其他步驟同1.3.1(zein與AG質量比為1∶1.5)。

1.3.4 不同pH值下納米顆粒粒徑、電位、PDI測定

用pH=3～9的磷酸鹽緩沖液分別對樣品進行pH調控。取1 mL新鮮制備的不同pH值的zein-AG納米顆粒稀釋至10倍，分散均勻后取1 mL放入樣品池后進行測定。

1.3.5 不同鹽離子摩爾濃度下納米顆粒粒徑、電位、PDI測定

移取10 mL新鮮制備的納米顆粒，加入10 mL不同鹽離子摩爾濃度(0～100 mmol/L)溶液攪拌均勻后靜置30 min。取1 mL新鮮制備的含不同鹽離子摩爾濃度的zein-AG納米顆粒稀釋至10倍，分散均勻后取1 mL放入樣品池后進行測定。

1.3.6 掃描電鏡

將最優條件下所制得納米顆粒經旋蒸除去乙醇后放入冷凍干燥機中凍干得固體樣品，取少許樣品放置于導電膠上固定后噴金，采用電子束對樣品進行微觀形貌拍攝，探針電壓為30 kV, 電流為50 pA，電子束加速電壓為5 kV, 放大倍數為20 000倍[9]。

1.3.7 負載TOC的納米顆粒制備

稱取0.5 g zein溶解于10 mL體積分數80%乙醇中，磁力攪拌30 min作為zein儲備液，稱取2 g AG溶解于10 mL去離子水中，磁力攪拌1 h得到AG儲備液；量取800 μL zein儲備液，并加入相應體積TOC，磁力攪拌30 min以充分溶解(按照zein-AG與TOC質量比1∶1、1∶2、1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)得負載TOC的zein儲備液；取800 μL TOC-zein儲備液呈細流狀移至38.9 mL的去離子水中，隨后移取300 μL AG儲備液至去離子水中(zein與AG質量比為1∶1.5，前期實驗所得最優比例)，磁力攪拌60 min后4 000 /min離心10 min 后取上清液得TOC-zein-AG納米顆粒。

1.3.8 不同zein-AG與TOC質量比納米顆粒粒徑、電位、多分散指數(PDI)測定

制備不同zein-AG與TOC質量比(1∶1、1∶2、1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)的納米顆粒，取1 mL新鮮制備的不同TOC含量的zein-AG納米顆粒稀釋至10倍，分散均勻后取1 mL放入樣品池后進行測定。

1.3.9 TOC包封率測定

zein-AG納米顆粒對生育酚包封率測定：移取5 mL負載生育酚的納米顆粒、3 mL石油醚置于燒杯中，置于磁力攪拌器上攪拌60 min萃取得游離的生育酚，用0.22 μm有機膜過濾，重復萃取3次，合并萃取液，用石油醚稀釋至10倍，以石油醚作為空白對照，在 298 nm下測定樣品的吸光值，根據TOC在石油醚中的標準曲線方程：y=0.007 8+0.009，R2=0.995，算出游離生育酚含量后，按照式(1)計算包封率[10]：

(1)

2 結果與分析

2.1 不同zein儲備液質量濃度下zein-AG納米顆粒粒徑、PDI、電位值

如圖1-a所示，隨著zein儲備液質量濃度的升高，10～5 g/L內粒徑無顯著性變化，維持在125 nm，PDI均在0.3以下；高于50 g/L時，粒徑顯著上升，達到200 nm左右，PDI也上升至大于0.3；如圖1-b所示，隨著zein初始儲備液濃度的升高，電位變化與粒徑均向不穩定趨勢變化，即10～50 g/L內電位在-32 mV左右無顯著性變化，zein儲備液質量濃度高于50 g/L時，電位顯著增大，但仍小于-25 mV；zein儲備液濃度較低時，zein分子充分分散到水相中，體系較為穩定；當zein在80%乙醇中濃度過高時，溶解的zein達到飽和狀態，部分過剩的zein分子影響其反溶劑制備過程中納米顆粒的粒徑和PDI值。該結果與王麗娟[11]、FU等[12]研究果膠復配zein納米顆粒時提出的zein初始儲備液質量濃度過高影響納米顆粒粒徑的假設結果一致。由圖1可知，制備zein-AG納米顆粒時，應選取5 g/L的zein儲備液質量濃度，既能夠有效提高制備效率，又不對粒徑、電位等指標產生負面影響。

圖1 不同質量濃度zein儲備液下zein-AG納米顆粒粒徑、PDI、電位對比圖Fig.1 The effect of the different concentrations of zein in the particle size, PDI, zeta- potential of the zein-AG nanoparticles

2.2 不同醇水比下zein-AG納米顆粒粒徑、PDI、電位值

如圖2-a所示，隨著醇水比的增大，粒徑無顯著性變化，控制在125 nm，PDI控制在0.2～0.35間，呈現降低趨勢但無顯著變化；如圖2-b所示，隨著醇水比的提高，電位也無顯著性變化，總體趨勢為電位降低，控制在-32 mV左右。綜合圖2可知，體系中乙醇與水的比例對體系的影響不顯著，可能是因為zein分子完全溶解于80%乙醇中，經過液-液自組裝后由于zein獨特的自組裝性和AG的有效結合[13]，使得納米顆粒均穩定分散在水體系中。該結果與YING提出zein制備得納米顆粒對于乙醇的依賴性較低，且親水膠體的結合有利于顆粒在水中的穩定性的結果一致[14]，因此從工業制備節約成本方面考慮，體系中應盡可能減少高成本乙醇的加入，選擇醇水比為1∶50進行制備使納米顆粒能夠穩定存在。

圖2 不同醇水比下zein-AG納米顆粒粒徑、PDI、電位對比圖Fig.2 The effect of the different ratio of the ethanol∶water in the particle size, PDI, zeta-potential of the zein-AG nanoparticles

2.3 不同pH值下zein-AG納米顆粒粒徑、PDI、電位值

不同pH下納米顆粒粒徑、PDI如圖3-a所示，粒徑在120～140 nm無顯著變化；PDI在pH=3時稍大于0.3，pH=4～9時均小于0.3呈穩定態，不同pH下納米顆粒電位如圖3-b所示，在pH=3時，電位相對較低為-17.8 mV，可能是因為pH=3時AG的荷電量較低，從而zein-AG納米顆粒表面凈電荷較少，因此體系電位不太穩定[15]；在pH=4～9內，電位都較為穩定且為-30～-40 mV。zein-AG納米顆粒在pH=3～9條件下均能較好保持納米顆粒狀態并維持穩定，相比單純zein納米顆粒在等電點附近嚴重聚集的現象有顯著改善。該結果與黃曉霞等研究果膠復合zein在pH=3較接近果膠的等電點時電位略低，pH=4～9時穩定性非常好的結果一致[16]。

圖3 不同pH下zein-AG納米顆粒粒徑、PDI、電位圖粒徑、PDI；電位Fig.3 The effect of pH in the particle size, PDI, zeta-potential of the zein-AG nanoparticles

2.4 不同鹽離子濃度下zein-AG納米顆粒粒徑、PDI、電位值

不同鹽離子濃度下納米顆粒粒徑、PDI、電位如表1所示。鹽離子濃度在0～20 mmol/L內，粒徑、PDI隨著鹽離子濃度升高而顯著增大至290.3 nm，電位逐漸增大至-20.2 mV，體系變得不穩定；鹽離子濃度大于20 mmol/L時粒徑為微米級，納米顆粒嚴重絮凝，PDI為1；電位為-5 mV左右，即對鹽離子耐受程度較弱，表明AG與zein通過靜電相互作用結合而成[17]，作用力能夠抵抗20 mmol/L的鹽離子濃度。LUO等研究低離子強度下納米顆粒就會發生絮凝的結果與該結果相同[18]。

表1 不同鹽離子濃度下納米顆粒粒徑、PDI、電位表Table 1 The effect of PH in the the different concentrations of salt in the particlesize, PDI, zeta-potential of thenanoparticles

注：表中相同字母代表差異不顯著(p<0.05);不同字母代表差異顯著(p<0.05)。下同。

2.5 zein-AG納米顆粒掃描電鏡結果

圖5所示是zein納米顆粒和zein-AG納米顆粒的掃描電鏡的微觀圖，其中zein-AG納米顆粒為最優條件(5%的zein儲備液質量濃度、醇水比為1∶50)下制備所得。

a-zein 納米顆粒；b-zein-AG納米顆粒圖5 納米顆粒掃描電鏡圖(×20 000)Fig.5 The SEM of the nanoparticles

圖5-a顯示，未復合AG的zein納米顆粒大小不均一，且有明顯粘連，因為zein納米顆粒的復溶性較差導致其顆粒間存在聚集狀態；該結果與黃旭琳等[19]研究結果相同；圖5-b顯示zein-AG納米顆粒呈現圓形，大小均一，且AG、zein沒有分離狀態，而是較好的復合在一起，該微觀圖與[11]等研究果膠復合zein納米顆粒掃描電鏡圖反映出的結果相同，即AG能夠通過靜電相互作用結合zein形成穩定的納米顆粒。

2.6 不同zein/AG與TOC質量比納米顆粒負載生育酚粒徑、PDI、電位值

不同zein/AG∶TOC比例納米顆粒粒徑、PDI如圖6-a所示，隨著納米顆粒負載生育酚濃度的變大，粒徑逐漸增高，小于1∶5時，負載生育酚的納米顆粒粒徑、PDI均較為穩定，此時TOC能夠完全結合納米顆粒；zein/AG與TOC質量比為1∶5時粒徑為180.3 nm，PDI為0.29；大于1∶5時納米顆粒粒徑較大達到200 nm；PDI也大于0.3；圖6-b所示隨著zein/AG與TOC質量比減小，納米顆粒電位也逐漸下降，大于1∶1.5時電位雖下降但無顯著性，在-30 mV左右。該結果與WONGSASULAK等研究結果一致[20]。綜上所述，zein/AG與TOC質量比1∶5時粒徑、PDI、電位和包封率既穩定又高效，達到zein大分子高效負載生育酚的目的。

圖6 不同zein/AG與TOC質量比納米顆粒粒徑、PDI、電位對比圖Fig.6 The effect of zein/AG∶TOC in the particlesize, PDI, zeta- potential of the nanoparticles

2.5 zein-AG納米顆粒負載生育酚包封率

由表2可知，隨著zein-AG納米顆粒負載生育酚含量的增大，體系包封率逐漸下降，在zein/AG與TOC質量比小于1∶5時，包封率逐漸增大至94.1%但無顯著性，此時納米顆粒體系中TOC的比例較小，能夠完全被zein-AG結合，因而負載能力較強；在zein/AG與TOC質量比大于1∶5時，包封率顯著降低，TOC比例過高導致負載能力較弱。zein/AG與TOC質量比為1∶5時，包封率仍達到86.9%。管驍等研究麥醇溶蛋白負載白藜蘆醇時，負載率為90.4%能夠支撐上述結果[21]；SUN等研究納米顆粒負載姜黃素時，姜黃素含量越高包封率越低的結果一致[22]。

表2 不同zein/AG與TOC質量比下納米顆粒對生育酚的包封率Table 2 The effect of zein/AG∶TOC of the encapsulationefficiency of TOC

3 結論

通過前期優化醇水比、zein儲備液質量濃度等參數制備得到的復合AG的zein納米顆粒能夠耐酸堿，并一定程度上耐受鹽離子，對于TOC的包封率較高達到90%左右，由此表明，AG可作為保護zein更好體內緩釋輸送藥物的一種親水性生物大分子進行使用， zein-AG復合納米顆粒也可作為TOC的有效載體應用于其活性的保護與長效利用。