液液萃取結合GC-O和GC-MS解析鎮江香醋香氣成分

袁源，范文來，徐巖

(教育部工業生物技術重點實驗室，江南大學 生物工程學院，釀造微生物與應用酶學研究室，江蘇 無錫，214122)

鎮江香醋是我國傳統發酵產品，以優質糯米為原料，采用傳統復式糖化、酒精發酵和醋酸固態分層發酵工藝，最后經陳釀而成，具有“色、香、酸、濃”的特點，以其濃郁的香氣而著稱于國內外，深受廣大消費者喜愛[1]。

為剖析鎮江香醋的香氣成分，較多的研究采用頂空-固相微萃取(head-space solid phase microextraction，HS-SPME)的方法。2007年通過HS-SPME與氣相色譜-聞香法(gas chromatography-olfactory，GC-O)聯用技術建立了鎮江香醋的香氣指紋圖譜[2]；2010年，應用同樣方法，初步得出乙酸、3-甲基丁酸、乙酸乙酯等16種物質為鎮江香醋的特征香氣物質[3]；2017年，研究人員[4]利用HS-SPME結合全二維飛行時間質譜(GC×GC-TOF-MS)在鎮江香醋中共檢測出360種揮發性物質，通過GC-O得出3-甲基丁醛、2,3-丁二酮、3-(甲硫基)丙醛等13種物質為重要香氣物質。此外，也有研究人員采用同時蒸餾萃取(simultaneous distillation extraction, SDE)研究鎮江香醋[5]，共檢測出32種香氣成分，并發現醋酸、吡啶、四甲基肼等物質在鎮江香醋中的含量較高。

然而，國外食醋風味物質研究多采用液液萃取(liquid-liquid extraction，LLE)[6-8]結合溶劑輔助風味蒸發(solvent assisted flavor evaporation，SAFE)的前處理方法。SAFE主要是去除萃取物中的色素、蛋白質和脂肪[9]，與HS-SPME技術相比，液液萃取技術處理的樣本量更大，更易于獲得一些含量微小，但可能對風味影響更大的化合物[10]。

本研究采用LLE結合SAFE的前處理方法，并將鎮江香醋中香氣化合物按酸堿性進行分離，以減少色譜峰重疊。應用香氣稀釋萃取法(aroma extract dilution analysis，AEDA)對鎮江香醋進行研究，以期發現更多的香氣物質。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

樣品：江蘇恒順醋業股份有限公司生產的恒順金梅牌鎮江香醋，于2017年9月12日購買自當地超市。

試劑：表1，表2中標有RI 的化合物標準品：色譜純，購于Sigma-Aldrich(上海)公司；乙醚、NaCl、無水Na2SO4、H2SO4、NaOH：分析純，購于中國醫藥(集團)上?；瘜W試劑公司。

1.2 儀器與設備

GC 6890 N 氣相色譜和5975 MSD 質譜儀,美國Agilent公司；ODP2 聞香儀,德國Gerstel公司；SAFE裝置,德國GlasblasereiBahr公司；Avanyi J-E高速離心機,美國Beckman公司；N-EVAP111型氮吹儀,美國Organomation公司；Milli-Q 超純水系統,美國Millipore公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 LLE方法

食醋LLE會產生嚴重乳化現象。參考LANGOS等人[11]修改后的方法，配制質量濃度為172 g/L的K4[Fe(CN)6]·3H2O溶液，以及質量濃度534 g/L的ZnSO4·H2O溶液，各取20 mL，先后加入200 mL醋樣中，攪拌均勻后靜置30 min，沉淀蛋白等物質后，于4 000 r/min離心5 min，收集上清液。上清液加NaCl飽和，用120 mL重蒸乙醚萃取3次，收集萃取相(包括乳化層)，稱作“萃取液1”。

1.3.2 SAFE

根據參考文獻[12]，設置恒溫水槽溫度50 ℃，在冷阱和杜瓦瓶中加入液氮，打開真空泵，待系統壓力降至10-3Pa并穩定后，將“萃取液1”倒入滴液漏斗中，開始樣品SAFE。完成后取下接收瓶。待瓶內液體自然融化后，將瓶內液體用無水Na2SO4于-20 ℃干燥過夜，得到無色清亮萃取液，稱作“萃取液2”。

1.3.3 分餾

參照FAN等人方法[13]，將“萃取液2”置于分液漏斗中，加入100 mL煮沸后冷卻的超純水，加NaCl飽和，用10 mol/L NaOH溶液將pH調至9，收集有機相，此為“中-堿性組分”。將水相用5 mol/L H2SO4溶液調pH至2，然后用60 mL乙醚萃取3次(每次20 mL)，收集萃取相，即“酸性-水溶性組分”。將中-堿性組分和酸性-水溶性組分分別用無水Na2SO4于-20 ℃干燥過夜，氮吹至250 μL，分別進行GC-O分析。

1.3.4 GC-O

采用AEDA法[13]，挑選2名經過聞香培訓的碩士研究生進行聞香分析。用重蒸乙醚分別將中-堿性組分和酸性-水溶性組分以1∶3，1∶9，1∶27，……的比例依次稀釋，每人對每個稀釋度聞香分析3次，6次中至少有1次被嗅到則繼續稀釋，直到不能聞到香氣為止。每種物質的FD值為無法嗅到其香氣的最高稀釋度。

1.3.5 GC-MS條件

利用DB-FFAP(60 m×0. 25 mm × 0. 25 μm)色譜柱。色譜條件為：進樣口溫度250 ℃，載氣為He氣，流速2 mL/min，進樣量1 μL，不分流進樣，樣品隨載氣一半進入檢測器，一半進入聞香裝置。升溫程序為：50 ℃保持2 min，然后以6 ℃/min 速率升溫至230 ℃，并保持15 min。質譜條件：EI電離源；電子能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；掃描范圍：35～350 amu。

1.3.6 化合物定性

根據改進的KOVATS[14]法計算化合物保留指數(RI)。通過與NIST庫的標準質譜圖比對、RI、香氣描述與標準品RI、香氣描述比對確認。

2 結果與討論

應用LLE結合SAFE提取、分離鎮江香醋香氣化合物，并分為中-堿性和酸性-水溶性組分。應用AEDA共檢測到60種香氣化合物，包括羰基類5種、酯類3 種、脂肪酸類16種、醇類2種、芳香族類20種、內酯類1種、雜環類10種以及含硫化合物3種；在酸性-水溶性和中-堿性組分中分別檢測出37種和27種香氣物質。

2.1 酸性-水溶性組分

酸性-水溶性組分中含有大量的脂肪酸、酚類和芳香酸(表1)。

酸類主要貢獻醋酸和奶酪香。3-甲基丁酸FD最高(FD=729)，是鎮江香醋的最重要香氣化合物(表1)；其次，乙酸FD=243，可能是重要香氣化合物。3-甲基丁酸由L-亮氨酸經微生物降解產生，乙酸由醋酸菌作用于乙醇生成[15]。此外，新發現6種不飽和烯酸，分別為2-甲基-2-戊烯酸、2-丁烯酸、3,3-二甲基丙烯酸、3-甲基-3-丁烯酸、2-戊烯酸和4-甲基-2-戊烯酸，大多呈現酸、水果、汗臭等氣味，但FD值較低，可能對香氣有貢獻。

在酸性-水溶性組分中共檢測到15種芳香族化合物，香蘭素的FD值最高(FD=729)，為最重要香氣化合物。該化合物呈甜香、香草氣味(表1)；其次是2-苯乙酸和愈創木酚的FD值較高(FD=243)，是重要香氣化合物，它們分別呈玫瑰花和丁香、煙熏氣味。此外，通過GC-O首次在中國食醋中檢測到2,6-二甲氧基苯酚、3-苯丙酸、香草酸乙酯、丁香醛、3,4,5-三甲氧基苯酚等芳香族化合物的特征香氣，其中2,6-二甲氧基苯酚(FD=81)呈煙熏氣味，由木質素在固態發酵階段降解產生[16]。

在醇類物質中，3-甲基-1-丁醇的FD值相對較高(FD=81)，呈指甲油氣味。

表1 鎮江香醋酸性-水溶性組分香氣化合物的聞香結果Table 1 Aroma-active compounds of Zhenjiang aromatic vinegar in acidic-water soluble fraction detected by AEDA

注：a：RIFFAP，化合物在FFAP 極性柱上的保留指數；RIL，參考文獻保留指數；b：MS，化合物通過質譜檢測；RI，標準品的保留指數；aroma，化合物通過聞香確認。表2 同。

2.2 中-堿性組分

中-堿性組分主要含有羰基類、酯類、雜環類和芳香族類化合物(表2)。

羰基類化合物中，2,3-丁二酮呈現黃油、奶油氣味，FD值較高(FD=243)，是重要香氣化合物。此外，呈蘑菇氣味的1-辛烯-3-酮、呈麥芽氣味的2-甲基丁醛和3-甲基丁醛對總體香氣也有一定貢獻(FD≥81)。

酯類物質中，乙酸異戊酯和乙酸乙酯的FD值相對較高(FD≥81)，對醋的香氣有一定貢獻。文獻報道乙酸乙酯為雪莉醋的關鍵香氣物質[6]，但在鎮江香醋中不是關鍵香氣物質(FD=81)。

雜環類化合物中，2,3,5,6-四甲基吡嗪是最重要香氣化合物(FD=729)，呈焙烤、堅果氣味?？啡┦侵匾銡饣衔?FD=243)，呈杏仁、甜香氣味，大量產生于陳釀過程[15]。

本文共檢測到3種含硫化合物，3-(甲硫基)丙醛、3-(甲硫基)-1-丙醇和3-(甲硫基)-1-丙酸。3-(甲硫基)丙醛，呈煮土豆氣味，有著最高的FD值(FD=729)，是鎮江香醋最重要香氣化合物；3-(甲硫基)-1-丙醇也呈煮土豆氣味，其FD=243，為重要香氣化合物。3-(甲硫基)-1-丙酸呈咸菜氣味，存在于酸性-水溶性組分(表1)，是在國內食醋中首次發現的含硫化合物。

3 結論

本研究采用LLE結合SAFE前處理手段，并將萃取液酸性-水溶液組分和中性-堿性組分，利用AEDA檢測鎮江香醋的香氣成分，共檢測到60種香氣物質，酸類、芳香族類、雜環類和含硫類化合物對鎮江香醋的香氣貢獻較大?；贔D值(FD=729)，鎮江香醋最重要的香氣物質是3-(甲硫基)丙醛、2,3,5,6-四甲基吡嗪、3-甲基丁酸和香蘭素；重要香氣化合物(FD=243)是2,3-丁二酮、乙酸、糠醛、3-(甲硫基)-1-丙醇、愈創木酚、2-苯乙酸以及γ-壬內酯。