基于組學及感官評價的酸奶風味研究

耿明雪，劉小鳴，趙建新，張灝，陳衛

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

酸奶是一種以牛奶為原料，經發酵后獲得的一種發酵乳制品，目前市售酸奶多由嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌亞種發酵而成。酸奶具有獨特的風味，其風味物質包括揮發性物質和非揮發性物質。目前，大多研究只關注了酸奶中的揮發風味物質，對非揮發性物質的關注較少。

近年來，已經于酸奶中檢測出超過90種風味物質，主要包括糖類、醇類、醛類、酮類、酸類、酯類、含硫化合物、吡嗪類化合物和呋喃衍生物，通常認為乙醛和2,3-丁二酮(又稱雙乙酰)是酸奶的主要風味物質[1]。CHENG等人[2]發現，乙醛和雙乙酰能分別賦予酸奶青蘋果味和奶香味。但是SANDINE等人[3]發現發酵乳中過量的乙醛會產生強烈的“辛辣味”，過量的雙乙酰也會引起不良口感。GALLARDO-ESCAMILLA等[4]利用部分最小二乘法設計模型嘗試解析感官和揮發性化合物間的相互作用，推測與果味有關的揮發性化合物有3-庚酮、丙酮、2-丁酮、3-羥基-2丁酮。

目前，對發酵乳制品中非揮發性物質的研究多側重于糖和有機酸方面。UPRETI等[5]用HPLC法測定了切達奶酪在后熟期內殘余糖分以及水溶性有機酸含量。楊小琪等人[6]采用HPLC方法檢測酸奶中的9種有機酸含量，但未同時測定酸奶中糖類物質及其他非揮發性物質的含量。GC-MS衍生化法已被[7]應用于檢測微生物細胞中碳代謝的數百種代謝物(氨基酸、非氨基有機酸、磷酸化有機酸和脂肪酸中間體)。因此可以將GC-MS硅烷化衍生法應用于酸奶非揮發性物質的分析中。

本文選取了10種常見市售酸奶，采用組學的研究手段對其揮發性物質和非揮發性物質進行全面測定，并進行感官評價分析。利用偏最小二乘法分析市售酸奶風味感官與揮發性物質的相關性，采用冗余分析法分析其滋味感官與非揮發性物質的相關性，解析了酸奶風味形成對應的風味化合物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

從本地超市購買A、B、C、D、E、F六個廠家的10種酸奶為實驗材料，其中原味酸奶樣品編號為CA1、CB1、CB2、CC1、CC2、CD1、CE1、CF1；老酸奶編號為CA2、CC3。樣品儲存于實驗室4 ℃冰箱中，各項指標均在保質期內測定。

1.1.2 試劑

NaCl、無水CuSO4、濃H2SO4、95%乙醇、無水乙醚、石油醚(30～60 ℃沸程)、K2SO4、NaOH、酚酞，均為分析純；甲醇、癸酸乙酯(99%，內標)、吡啶、核糖醇(純度>97%，內標)、甲氧胺鹽酸鹽、N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA，99%)，均為色譜純。

1.1.3 儀器與設備

凱氏定氮儀，丹麥FOSS公司；恒溫鼓風干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司；氣相色譜三重四級桿質譜聯用儀GCMS-TSQ 8000 Evo，美國賽默飛世爾科技公司；80 μm CAR/PDMS萃取頭，美國Sigma公司；冷凍濃縮離心干燥，美國LABCONCO公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 感官評價

1.2.1.1 評價員的篩選與培訓

鑒于感官實驗的持久性，評價員的招募和篩選主要針對食品專業在校學生。按照GB/T 16291.1—2012[8]中所述方法，分別對評價員的基本味道識別能力、觀察閾、識別閾進行測定，最終確定12個感官靈敏的候選人，男女比例是1∶1。參考ELORTONDO等人[9]的方法對評價員進行基本知識及評價方法的培訓。感官描述詞來自感官分析術語[10]、文獻中詞匯[11-12]。按照國標[13]對評價員進行一致性訓練，每周培訓2次，持續2周。

1.2.1.2 酸奶感官描述詞

經感官培訓后最終確定酸奶氣味感官評定詞為甜味、酸味、奶香味、乳脂味、果香味、青蘋果味、香草味、蒸煮味、乳粉味、硫味；滋味感官評定詞為甜味、酸味、澀味、奶香味、乳脂味、果香味、青蘋果味、香草味、蒸煮味、乳粉味、硫味、不潔味、不自然感。對上述描述詞進行定義并確定參照樣，如表1所示。

表1酸奶風味感官描述詞
Table1Descriptivesensorylanguageofyogurt

描述詞定義參照樣甜味是由糖類的水溶液產生的一種基本味道16 g/L的蔗糖水溶液酸味是由酸性物質的稀水溶液產生的基本味道,舌黏膜受到氫離子的刺激引起的0.08%的檸檬酸水溶液奶香味雙乙酰物質產生的味道雙乙酰,20 μg/L蒸煮味煮牛奶的味道,牛奶熱變性產生巰基引起的把牛奶加熱到85℃持續30 min硫味含硫化合物的味道煮熟搗碎的雞蛋水果味牛乳中的嗜冷菌繁殖所分泌的丁酸酯、異戊酸酯和己酸酯的積累引起的青蘋果味酸奶中含有的乙醛物質,使酸奶具有新鮮的青蘋果味乳粉味乳清粉的香氣5 g乳清粉溶解到100 mL的水中乳脂味牛奶中脂肪相關的香氣

1.2.1.3 樣品的制備

挑選使用透明帶蓋的食品級塑料杯，稱取20 g酸奶樣品放入2個品嘗杯中，分別進行氣味、滋味感官評定。每次試驗鑒評的酸奶樣品數量控制在5個以內，樣品編號采用3位隨機數字。評價員每品嘗完一個樣品后用礦泉水漱口，每個樣品重復兩次。感官評分標準(0～9)：0(無)；1～3(較弱)；4～6(中等強度)；7～9(強)。

1.2.2 揮發性風味物質分析

參照SETTACHAIMONGKON等人[14]的方法利用SPME-GC-MS技術測定酸奶中揮發性風味物質并略作修改。室溫下稱取6 g酸奶樣品裝入20 ml萃取瓶中，同時加入1 g NaCl和2 μL 0.05 mg/mL癸酸乙酯的甲醇溶液。采用固相微萃取方法提取酸奶中的風味成分，萃取探頭是涂抹厚度為85 μm的CAR/PDMS，自動進樣器將萃取探頭插入密封的萃取瓶后，萃取頭暴露在樣品上部的空氣中，于50 ℃、條件下萃取30 min，解吸5 min，進行GC-MS分析。

氣譜條件：Rtx-WAX毛細管(30 m×0.25 mm，0.25 mm)；進樣口溫度225 ℃，分流比10，流速1 mL/min，載氣為氦氣；程序升溫：初始溫度30 ℃，保持3 min；15 ℃/min升溫至225 ℃，保持5 min。

質譜條件：離子化方式EI，發射能量為70 eV，發射電流為200 μA，檢測器電壓為1.4 kV，離子源溫度240 ℃，接口溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，質量掃描范圍m/z30～500。通過NIST 2001標準譜庫的檢索及標準品比對進行物質定性，并采用峰面積歸一化法定量。

1.2.3 非揮發性物質分析

參照ZHAO等人[15]的方法測定酸奶中非揮發性風味物質并略做修改。取30 mg凍干的酸奶樣品放入2.5 mL的離心管里，加入1 mL甲醇溶液、10 μL 2 mg/mL內標物質核糖醇溶液振蕩，12 000 r/min離心15 min，取0.5 mL放入1.5 mL離心管，用真空離心濃縮儀旋干，待樣品旋干后進行衍生化處理，加入100 μL 10 mg/mL甲氧羥胺吡啶，40 ℃ 90 min金屬浴，再加入40 μL BSTFA振蕩，75 ℃ 60 min金屬浴。用12 000 r/min 15 min離心，取上清，轉移到氣相瓶中(程序1：移60 μL到帶內插管的氣相瓶中；程序2：用二氯甲烷稀釋100倍移1 mL到氣相瓶中)，待測。

氣相色譜條件及升溫程序：Rtx-5MS毛細管(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；程序升溫1：柱初溫70 ℃，以5 ℃/min升至230 ℃，以90 ℃/min 升至320 ℃；程序升溫2：柱初溫70 ℃，以30 ℃/min升至230 ℃，以90 ℃/min 升至320 ℃，保持3 min；載氣(He)流速35.0 cm/sec，進樣量1 μL；分流進樣：1∶10。

質譜條件：電子能量70 eV；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度300 ℃；四極桿溫度150 ℃；質量掃描范圍m/z33～600。由GC-MS得到的譜圖，在NIST 2001標準譜庫的檢索及標準品比對進行物質定性，并采用峰面積歸一化法定量。

1.3 數據分析

應用SPSS 16.0統計軟件對實驗數據進行統計差異性分析；應用SIMCA-P+11分析軟件對感官數據進行主成分分析(principal component analysis，PCA)；對感官數據與揮發性風味物質進行偏最小二乘法分析(partial least squares regression，PLS)；應用Canoco分析軟件對非揮發性風味物質和滋味感官進行冗余分析(redundancy analysis，RDA)。

2 結果與討論

2.1 酸奶感官分析

2.1.1 酸奶氣味特征分析

市售酸奶的氣味感官分析結果如表2所示。氣味感官分析數據顯示了不同市售酸奶之間的風味差異。市售酸奶奶香味指標評分為3.7～5.6，果香味指標評分為1.3～3.4，青蘋果味指標評分為1.2～2.8，蒸煮味評分為1.7～4.2，硫味評分為1.0～2.3，乳粉味評分為1.3～4.2，喜好性評分2.8～6.7。市售酸奶中奶香味處于中等強度，果香味、青蘋果味弱，且還存在弱的蒸煮味、硫味、乳粉味。據評價員氣味感官喜好性表明，樣品CA1、CE1、CF1喜好性高；CA2、CB1、CB2、CC2、CE1喜好性適中；樣品CC1、CC3喜好性低。

表2 市售酸奶氣味感官評定結果Table 2 The results of descriptive aroma attributes of commercial yogurt

注：不同字母表示同一列數據之間存在顯著性差異(p<0.05)，n=12

采用PCA對酸奶氣味特征進行分析，前3個因子的特征值之和占總特征值的88.0%，能夠解釋原變量的大部分信息。由表3可知，第1主成分(PC1)重點反映了果香味、青蘋果味、香草味、喜好性4個指標的變異信息，且都處于PC1軸的正方向，特征向量值均大于0.6，這表明喜好性與果香味、香草味成主要正相關，與蒸煮味、硫味、乳脂味成主要負相關；第2主成分(PC2)重點反映了甜味、奶香味、乳粉味3個指標的變異信息，甜味、乳粉味處于PC2的正方向，奶香味處于PC2的負方向更接近于喜好性；第3主成分(PC3)重點反映了酸味1個指標的變異信息，發酵形成酸奶的過程中，牛奶中的乳糖會被分解成乳酸，生成的乳酸進一步代謝生成各種酸味化合物，賦予了酸奶特有的酸味[17]。綜上所述，酸奶以青蘋果味、奶香味、酸味為香氣主調，評定員偏向于青蘋果味、奶香味的酸奶。

表3 主成分載荷矩陣Table 3 Component Matrix

2.1.2 酸奶滋味特征分析

市售酸奶的滋味感官分析結果如表4所示。滋味感官分析數據顯示了不同市售酸奶之間的滋味差異。市售酸奶甜味評分4.7～6.2，酸味評分5.9～8，奶香味評分為4.8～6.4，果香味評分為1.8～4.2，青蘋果味評分為1.8～3.5，蒸煮味評分為1.9～4.0，硫味評分為0.6～2.8，不自然感1～3.4，喜好性評分為3.2～8。市售酸奶甜味、奶香味處于中等強度，硫味較弱，酸味、果香味、青蘋果味、蒸煮味、不自然感略有差異。據評定員滋味感官喜好性表明，樣品CA1、CB2、CA2、CF1喜好性高；樣品CB1、CC2、CE1喜好性適中；樣品CC1、CC3、CD1喜好性低。

表4 市售酸奶滋味感官結果Table 4 The results of descriptive taste attributes of commercial yogurt

注：不同字母表示同一列數據之間存在顯著性差異(p<0.05)，n=12。

表5 主成分載荷矩陣Table 5 Component Matrix

采用PCA對酸奶滋味特征進行分析前三個因子的特征值之和占總特征值的80.6%，能夠解釋原變量的大部分信息。由表5可知，第1主成分(PC1)重點反映了甜味、果香味、青蘋果味、澀味、乳脂味、不自然感、蒸煮味、硫味、不潔味9個指標的變異信息，特征向量值均大于0.6。其中甜味、果香味、青蘋果味和喜好性處于正方向，表明與喜好性呈顯著正相關；而澀味、乳脂味、不自然感、蒸煮味、硫味、不潔味處于負方向，說明與喜好性呈顯著負相關；第2主成分(PC2)重點反映了酸味、奶香味2個指標變異信息，特征向量值均大于0.6，且酸味、奶香味均處于正方向，與喜好性呈顯著正相關；第3主成分(PC3)重點反映了不自然感1個變異信息，與喜好性呈顯著負相關，可能為了彌補酸奶風味物質不足而添加了香精等物質。酸奶的氣味和滋味感官信息表明評定員更喜歡果香味、奶香味較強的酸奶，而目前大多數市售酸奶香味、果香味較弱，有些酸奶還具有較強的不佳風味，降低的酸奶的品質。

2.2 感官特性與風味物質的相關性分析

2.2.1 氣味感官特征與揮發性風味物質的相關性分析

采用SPME-GC-MS分析酸奶中主要的揮發性風味物質，共鑒定出23種物質，其中包括醛類4種、酮類7種、酸類6種、酯類2種、含硫化合物3種、醇類1種，各種市售酸奶中揮發性風味物質含量如表6所示。從表6中數據得知，乙醛含量為4.66～23.0 μg/kg，丙酮含量為3.55～30.66 μg/kg，2,3-丁二酮含量為43.41～180.97 μg/kg，乙酸乙酯含量為0.16～6.57 μg/kg。

表6 市售酸奶的揮發性風味物質含量 單位：μg/kg

注：不同字母表示同一行數據之間存在顯著性差異(p<0.05),n=3

A-市售酸奶氣味感官PCA分析圖; B-市售酸奶氣味感官和揮發性風味物質PLS分析(代表市售酸奶氣味感官屬性； 代表市售酸奶揮發性風味物質屬性)圖1 市售酸奶氣味感官特征與揮發性風味物質相關性分析圖 Fig.1 Correlation analysis between aroma feature and volatile compounds of commercial yogurt

將市售酸奶氣味感官數據與揮發性風味物質數據進行最小二乘法分析，如圖1-A所示。從該圖可以看出，樣本點分布在橢圓內，不存在特異性，模型的擬合效果較好，R2X[1]=0.548 988，R2X[2]=0.227 783能夠反映大部分樣品信息，精度較高。從圖1-B可以看出，喜好性與果香味、青蘋果味、香草味、奶香味呈正相關，與硫味、蒸煮味、乳脂味呈明顯負相關。2,3-丁二酮貢獻酸奶的奶香味和香草味；乙醛貢獻了酸奶的青蘋果味；丙酮、2-丁酮、酯類貢獻了酸奶的果香味；乳酸主要貢獻酸奶的酸味；己酸、癸酸能夠產生乳脂味；硫化物產生了硫味和蒸煮味。與OTT[18]和CHENG等人[2]研究結果一致。

從圖1中A、B可知，CA1、CB2、CE1的喜好度較高。這3種酸奶樣品的乙醛含量在13.2～23.09 μg/kg，2,3-丁二酮含量118.34～180.97 μg/kg，處于酸奶風味的中等強度，且3種酸奶中含硫化合物的含量相對低；CC1、CC2酸奶的喜好性低，酸奶中硫化物含量為1.60～6.12 μg/kg，相對較高，硫化物含量可以影響評價員對酸奶的喜好性。

綜上所述，奶香味、青蘋果味為酸奶的典型香味，分別與雙乙酰、乙醛密切相關。酸奶生產過程中，還會產生一些不佳風味如蒸煮味、乳脂味、硫味等。其中蒸煮味與二甲基二硫醚密切相關；乳脂味與有機酸有關；硫味與三甲基硫醚有關。評定員更喜歡果香味、奶香味的酸奶，而具有明顯蒸煮味、乳脂味、硫味的酸奶不受歡迎。

2.2.2 滋味感官特征與非揮發性物質的相關性分析

10種市售酸奶樣品中的非揮發性物質結果如表7所示。檢測出20種主要的非揮發性物質，其中有機酸3種、醛類物質1種、糖類物質12種、醇類物質2種、其他物質3種。酸奶中主要的有機酸物質包括乳酸、硬脂酸。乳酸可以促進乳蛋白的吸收；抑制腸內病原微生物的生長[19]。從表7可以得出酸奶中乳酸的含量為105.69～262.64 mg/100g，酸奶樣品CA1、CC1、CC3、CD1乳酸含量較高，CB1、CC2、CE1酸奶乳酸含量較低。酸奶中主要特征糖類物質有蔗糖、乳糖、葡萄糖、麥芽糖、纖維二糖、半乳糖、阿拉伯糖、L-(+)-蘇阿糖、D-(-)-赤蘚糖，酸奶中乳糖含量大約為2%～4%。從表7也可以得出酸奶中乳糖含量為1 745.7～4 936.2 mg/100g，蔗糖含量為484.7～1 588.6 mg/100g，其乳糖含量與WU等人[20]實驗結果一致。酸奶的制作過程中會加入一定量蔗糖，調節甜酸比提高酸奶品質。除此之外，醛、醇類物質也是酸奶重要的滋味物質，其中由乳酸菌代謝甘油三酯產生的丙三醇是酸奶中特征性的甜味物質。

表7 市售酸奶的非揮發性物質含量 單位：mg/100g

注：不同字母表示同一行數據之間存在顯著性差異(p<0.05)，n=3。

將市售酸奶的滋味感官和非揮發性物質做冗余性分析結果如圖2-B所示。從滋味感官角度分析，喜好性與甜味、果香味呈正相關，與澀味、酸味、乳粉味、乳脂味呈負相關，且滋味強度越強并不一定受到評定員喜愛。大多數評定員更偏向于滋味溫和的甜味、果香味酸奶。

A-市售酸奶滋味PCA分布圖；B-市售酸奶滋味感官和非揮發性物質RDA分析圖圖2 市售酸奶滋味感官特征與非揮發性物質相關性分析圖Fig.2 Correlation analysis between taste feature and non-volatile compounds of commercial yogurt

從圖2-B中可以看出，乳酸是酸奶酸味的主要來源；在檢測到的10種糖類物質中，蔗糖和半乳糖與甜味的對應性最高；D-(+)-葡萄糖醛酸γ內酯能賦予酸奶果香味。從圖2-A中可以看出，酸奶樣品中CA1、CB1、CE1受到評定員喜愛。CA1、CB1、CE1樣品中D-(+)-葡萄糖醛酸γ內酯的含量分別為13.36 mg/100 g、17.28 mg/100 g、 18.88 mg/100 g，該樣品中含有的D-(+)-葡萄糖醛酸γ內酯比其余樣品高；CA1、CB1、CE1樣品中滋味感官甜酸比大約為0.9時更受歡迎。

3 結論

從感官、風味物質方面分析表明市售酸奶之間存在差異。感官評定員對市售酸奶喜好性主要受奶香味、果香味、青蘋果味、酸味、甜味、蒸煮味、硫味、乳脂味、乳粉味影響。從市售酸奶樣品中共檢測出23種揮發性風味物質，其中丙酮、2-丁酮、酯類貢獻了酸奶的果香味；乙醛貢獻了酸奶的青蘋果味；2,3-丁二酮貢獻酸奶的奶香味和香草味。從市售酸奶樣品中共檢測出20種非揮發物質，包括酸類、糖類、酯類等。乳酸是酸奶酸味的主要來源；在檢測到的10種糖類物質中，蔗糖和半乳糖與甜味的對應性最高；D-(+)-葡萄糖醛酸γ內酯能賦予酸奶果香味。