頂空固相微萃取結合氣相色譜質譜-嗅聞聯用技術鑒定巧克力麥芽中可可特征風味物質

秦奔，張海鵬，鄭飛云，鈕成拓，劉春鳳，王金晶，李永仙，李崎

(江南大學 生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

麥芽是啤酒生產的主要原料之一，不同種類的麥芽生產出的啤酒在風味、口感以及顏色上都會有所差異[1]。巧克力麥芽因其特殊的風味和顏色，對啤酒品種的增加和豐富具有很好的作用[2]。麥芽的風味形成是個復雜的過程，通過美拉德反應以及焦糖化等作用，產生風味物質[3-5]，成品麥芽呈巧克力褐色，業界將具有700～1 300 EBC色度且具有類似巧克力風味的麥芽統稱為巧克力麥芽[6]。可可是制作巧克力的原料，由于巧克力是經過加工后的產品，風味差異較大，所以一般以可可風味來代表巧克力風味。在啤酒釀造過程中，添加少量的巧克力麥芽就能給成品啤酒帶來獨特的色澤，并且具有堅果、咖啡或巧克力可可的風味特征[7-9]，除此之外，巧克力麥芽還被應用于其他食品的生產[10]。

通過氣相色譜-質譜聯用(gas chromatography-olfactometry-mass spectrometer,GC-MS)技術能夠對揮發性物質進行檢測與定量[11-12]，但該技術無法感知氣味與風味強度。本文選用氣相色譜質譜-嗅聞聯用(gas chromatography-olfactometry-mass spectrometer, GC-O-MS)技術，在GC-MS的基礎上，連接一個嗅聞裝置，以人的嗅覺為檢測器，對風味進行描述，并且感知風味強度。由于GC-O-MS具有的感知氣味，以及時間-強度法實驗操作次數少，能夠快速推斷樣品中的主要特征風味物質等優點，使得GC-O-MS技術在香精、食品等領域應用廣泛[13]。本研究選用頂空固相微萃取(headspace-solid phase micro-extraction,HS-SPME)技術結合氣相色譜-質譜-嗅聞聯用(GC-O-MS)分析并鑒定巧克力麥芽中的可可特征風味物質，能夠為巧克力麥芽的定義、深入研究以及指導生產提供理論性參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

麥芽：淺色麥芽(加拿大麥芽)，購自中糧麥芽(江陰)有限公司；巧克力麥芽1號(美國)，購自上海金啤食品原料有限公司；巧克力麥芽2號(樂斐)、焦香麥芽、黑麥芽，購自新西蘭Gladfield公司；巧克力麥芽3號(維耶曼)、巧克力麥芽4號(比利時)、巧克力麥芽5號(比利時城堡)、巧克力麥芽6號(歐麥)，市售麥芽。

標樣：2,6-二甲基吡嗪(99%，Adamas)，三甲基吡嗪(99%，Adamas)，2-乙基-3,5-二甲基吡嗪(95%，Aldrich)，2-甲氧基-3-甲基吡嗪(99%，Aladdin)。

1.2 儀器與設備

DLEUW22050麥芽粉碎機，Buhler-Miag公司；氣相色譜質譜聯用儀(GCMS-QP2010)，日本島津(Shimadzu)公司；嗅覺檢測器，德國Gerstal公司；SPME手動進樣器、萃取纖維頭2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS、20 mL具塞頂空瓶，美國Supelco公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗條件

1.3.1.1 色譜條件

色譜柱：DB-WAX(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升溫程序：45 ℃保持1 min，以6 ℃/min速度上升到230 ℃，保持6 min；載氣為He氣，流速1.5 mL/min；進樣口溫度250 ℃，解吸時間1 min；不分流。

1.3.1.2 質譜條件

離子源EI源；離子源溫度：200 ℃；四級桿溫度：150 ℃；電子能量：70 eV，掃描質量范圍33～400 u；進樣條件：手動進樣。

1.3.2 樣品預處理以及SPME提取方法

取低溫下保存的麥芽樣品10 g，用粉碎機粉碎，精確稱取3.00 g麥芽細粉倒入20 mL具塞頂空瓶中，加蓋密封，在60 ℃水浴中平衡10 min，然后用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭在具塞頂空瓶中上部吸附萃取50 min，在氣相色譜進樣口250 ℃進行解吸，解吸時間1 min。

1.3.3 GC-O分析方法

在毛細管柱出口處連接嗅聞裝置，質譜和嗅聞裝置分流比為1∶1。實驗之前，選定實驗室感官評定小組中3個經過風味訓練、并有一定經驗的研究人員作為感官品評員進行GC-O嗅聞實驗。實驗過程中，在同一嗅聞風味出峰點，至少需要有兩位感官評定員嗅聞得到相同的感官描述，才能記入最終的結果。感官評定員不僅要對物質的香氣進行描述，還要確定風味化合物的香氣強度。實驗選擇5分制來進行香氣強度的評價，即“0”表示沒有香氣，“1”表示香氣微弱，“2”表示香氣較弱，“3”表示香氣中等，“4”表示香氣較強，“5”表示香氣很強，有刺激性味道。

1.3.4 化合物定性方法

風味物質經過質譜儀分析得到的數據通過NIST標準譜庫檢索，選擇匹配度最高的鑒定結果，并在相同色譜條件下，通過對C6～C30正構烷烴的色譜掃描，計算得到各化合物的保留指數(retention index，RI)值，與相應的文獻值[14]進行對照，同時，經過感官評定員嗅聞描述的化合物香味特征與文獻報道結果對比，驗證定性結果。

1.3.5 OAV值的計算方法

1.3.5.1 標準曲線的制作

將3種吡嗪類化合物標樣配置成混標，并稀釋成10、50、100、500、1 000 μg/L的質量濃度梯度，以50 μg/L的2-甲氧基-3-甲基吡嗪作為內標物質進行校正，取5 mL混標以及50 μL的內標溶液進行GC-MS檢測，并以各標樣濃度為橫坐標，吡嗪類化合物與內標的峰面積比值為縱坐標，分別做標曲。

1.3.5.2 三種吡嗪類物質的定量檢測

取低溫下保存的麥芽樣品10 g，用粉碎機進行粉碎，精確稱取5.00 g的麥芽細粉，溶于100 mL水中，45 ℃下浸提30 min，升溫至70 ℃浸提60 min，取5 mL浸提液以及50 μL的內標溶液，采用內外標法進行GC-MS定量檢測。

1.3.5.3 OAV的計算方法

根據內外標法對麥芽中的香氣成分的定量檢測結果以及各物質的香氣閾值，按式(1)計算OAV值。

(1)

式中：C,根據內外標法得出的該化合物的質量濃度,μg/kg；OT,該化合物的嗅覺閾值,μg/kg。

2 結果與討論

2.1 巧克力麥芽1號樣品GC-O-MS分析

通過GC-O-MS技術對市售麥芽樣品巧克力麥芽1號的風味物質進行了檢測與分析，共檢測得到47種揮發性化合物，包括14種醛類、7種醇類、5種酮類、5種酸類、6種吡嗪類以及其他一些特殊的風味物質。其總離子流圖譜見圖1，并對各種風味物質進行香氣描述，記錄其風味強度，其檢測結果如表1所示。

圖1 巧克力麥芽1號總離子流圖Fig.1 The total ion flow diagram of chocolate malt 1

由于揮發性風味物質之間存在疊加、協同的作用，多種風味化合物共同構成了麥芽的風味。根據不同風味物質的香氣強度，能夠判斷出單一風味物質對麥芽整體風味的貢獻度，同時，根據對風味化合物的感官描述，能夠找出具有不同風味特征的物質[15]。表1顯示了巧克力麥芽1號所檢測出的47種風味物質的保留時間、化合物名稱、匹配度、風味描述、風味強度、峰面積以及峰面積百分比。其中11種風味化合物的氣味明顯(風味強度>3)，對巧克力麥芽風味組成貢獻較大，分別是3-甲基丁醛(麥芽香)、庚醛(奶油脂香)、2,6-二甲基吡嗪(可可香)、三甲基吡嗪(可可香)、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪(可可香)、醋酸(酸味)、糠醛(杏仁、焦糖香)、菠蘿酮(焦糖香)、順式-5-甲基-2-異丙基-己烯醛(堅果、花生)、2-乙酰吡咯(烤面包)、麥芽酚(焦糖香)，其中具有可可特征風味(可可香)的化合物有三種，它們對巧克力麥芽中的可可風味貢獻最大，分別為2,6-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪。

表1 GC-O-MS測定巧克力麥芽1號中揮發性風味化合物Table 1 Determination of volatile flavor compounds in chocolate malt I by GC-O-MS

注：嗅聞強度中， “1”表示香氣微弱，“2”表示香氣較弱，“3”表示香氣中等，“4”表示香氣較強，“5”表示香氣很強，有刺激性味道。

2.2 可可特征風味物質的鑒定

2.2.1 三種吡嗪類物質的性質

3種吡嗪類物質同屬于烷基吡嗪類，2,6-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪天然存在于肉、可可、咖啡等食品中，而2-乙基-3,5-二甲基吡嗪天然存在于炒花生、咖啡、炒大麥及爆米花等中，食品中這3種吡嗪類物質都是在焙烤、炒制過程中通過美拉德反應等作用產生的，并且這3種吡嗪類物質都是國標中允許使用的食品香精，主要用于配制巧克力、咖啡、烤堅果等香精[16]。

2.2.2 與可可粉的比較與分析

由文獻可知，可可粉中具有的可可特征風味物質有3種，分別是2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪以及2,3,5,6-四甲基吡嗪[17]，在可可加工和巧克力制品中都是重要的特征性風味物質。其中，2,5-二甲基吡嗪與2,6-二甲基吡嗪互為同分異構體，出峰時間相近，實驗檢測中可能出現風味掩蓋的現象。而2,3,5,6-四甲基吡嗪在本實驗中未能檢測到。由于巧克力麥芽與可可粉的原料以及生產工藝存在差異，而巧克力麥芽只是具有類似可可、巧克力的風味，所以巧克力麥芽的可可特征風味物質并不一定與可可粉完全相同。

2.2.3 不同麥芽樣品吡嗪類物質的比較與分析

由文獻可知，特種麥芽中所具有的可可、咖啡、堅果以及烘烤味等風味一般是由烷基吡嗪類化合物產生的[18-19]，與本文GC-O結果相符。在焙烤過程中，吡嗪類物質通過美拉德反應等作用產生[20]，其含量隨著焙烤程度的加深先增加后減少，呈鐘形變化[21]。為了驗證在不同的巧克力麥芽樣品中是否都具有2,6-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪這三種吡嗪類物質，選擇國內外市場上常見的6種品質優良的巧克力麥芽樣品以及淺色麥芽、焦香麥芽和黑麥芽樣品，對吡嗪類物質種類進行了比較與分析，其結果如表2所示，“ND”表示未檢測出。

表2 不同麥芽樣品中吡嗪類物質分析Table 2 Analysis of pyrazines in different malt samples

由表2可知，巧克力麥芽1號樣品中的12種吡嗪類物質，幾乎都可以在其他5種巧克力麥芽樣品中檢測到，而在淺色麥芽中幾乎檢測不到吡嗪類物質，在焦香麥芽以及黑麥芽中吡嗪類物質種類較少、含量較低，說明巧克力麥芽與其他種類麥芽的吡嗪類物質種類及相對含量都有明顯的差異。實驗結果表明，巧克力麥芽的焙烤程度處于烷基吡嗪類物質生成量較高的時期，由于這3種吡嗪類物質都是在焙烤過程中產生的，并且產品原料都來自于大麥，可以確定在巧克力麥芽中都具有這三種吡嗪類物質，其主要差異在于物質的含量。

2.2.4 麥芽樣品中吡嗪類物質的香氣閾值及香氣活度值(OAV)

巧克力麥芽中吡嗪類物質雖然含量較低，但是由于其風味閾值極低，所以吡嗪類物質對麥芽風味的貢獻很大。對麥芽樣品中3種吡嗪類物質進行了定量檢測與分析，其線性關系、香味閾值以及OAV值如表3所示。

表3 麥芽樣品中三種吡嗪類物質的線性關系、香氣閾值以及OAV值Table 3 The odor threshold, linearity and OAV of three pyrazines in the sample of Malt

注：a各物質在葵花油中測定的香氣閾值；b各物質的OAV值均保留兩位小數；c嗅覺閾值數據來源于文獻[22]；d嗅覺閾值數據來源于文獻[23]。

由于麥芽基體中的吡嗪類物質的香氣閾值并未報道，所以本文統一選用葵花油中測定的香味閾值[22-23]。將5.00 g粉碎后的麥芽經浸提后，再通過GC-MS技術進行定量檢測，計算得到OAV值。表3結果表明，巧克力麥芽中，2,6-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪這3種吡嗪類物質的OAV值都大于1，對整體香氣的貢獻較大。

3 結論

本論文采用頂空固相微萃取技術結合GC-O-MS技術，分析并鑒定了巧克力麥芽樣品中的可可特征風味物質，并通過OAV值以及與其他樣品麥芽的比較進行驗證。結果表明，在這類巧克力麥芽中，具有巧克力可可特征風味的化合物有3種，對巧克力麥芽的可可風味貢獻較大，分別為2,6-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪。本研究所得到的結論也將為巧克力麥芽的定義、研究以及生產提供理論性參考依據。由于巧克力麥芽原料、制麥及焙烤生產過程中的不穩定性，導致巧克力麥芽的生產質量與風味品質無法得到保證，因此巧克力麥芽制作過程中的物質變化、條件控制以及風味穩定性將作為以后研究的重點問題。