細腳擬青霉RCEF4339原生質體制備工藝優化

杜林娜，魏東旭，李秀蘭，姚宇

(吉林農業大學 生命科學學院，吉林 長春，130118)

細腳擬青霉(Paecilomycestenuipes(Peck) Samson)為我國重要蟲生藥用真菌之一，在亞洲國家，該菌已作為保健食品原料和傳統營養藥物而得到了廣泛應用[1]。已有文獻報道表明，細腳擬青霉具有抗抑郁、降血糖、免疫調節和抗腫瘤等多種生物活性，已成為蟲生真菌的研究熱點[2-5]。然而，由于細腳擬青霉菌絲體中兩種重要活性成分即腺苷和蟲草素的含量較低，已嚴重限制了該菌的大規模開發和利用，因而采用一定方法選育得到細腳擬青霉腺苷和蟲草素高產菌株尤為重要。

原生質體是菌種改良、真菌生理學及生物化學研究的一種良好實驗材料，已成功地用于植物、蕈菌和真菌的遺傳特性改良[6-11]。原生質體的生成量是會受到很多因素的影響，例如，酶種類，酶濃度，酶解時間等[12-13]。因而，考察各因素對原生質體生成量的影響，優化并獲得最佳原生質體制備工藝，是細腳擬青霉菌種改良及遺傳轉化體系建立的前提條件。

為了解決這一問題并且簡化原生質體制備工藝的優化過程，本研究將細腳擬青霉原生質體生成量作為制備工藝優化過程中的響應值，并采用多種化學計量學的方法(包括Plackett-Burman設計試驗、Box-Behnken設計試驗、響應面法、神經網絡和遺傳算法)對該菌最佳的原生質體制備工藝進行優化，以提高細腳擬青霉的原生質體生成量，為深入開展細腳擬青霉的遺傳轉化、有效成分生物合成的分子機理及菌種改良研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

P.tenuipesRCEF4339購于安徽農業大學。葡萄糖、甘露醇、NaCl、KH2PO4、MgSO4·7H2O等均為分析純，蛋白胨、酵母浸粉等為國產生化試劑。

1.2 儀器與設備

YXQ-LS-75G立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊)；HYG-A全溫振蕩培養箱(太倉實驗)；SL-3001N電子天平(上海民橋)；IX51熒光倒置顯微鏡(日本Olympus)；ZHJH-C1112C超凈工作臺(上海智城)。

1.3.4 細腳擬青霉原生質體制備工藝優化方法

2.中國參與國際稅收征管協作方式較單一。《多邊公約》規定的國際稅收征管協作形式包括國際稅收情報交換、稅款追繳和文書送達，這三種協作方式共同作用，形成國際社會打擊國際逃避稅的強大征管網絡和合力。基于國內稅收征管能力的考慮，中國國內稅法中目前僅引入國際稅收情報交換的協作形式，其他兩種協作形式暫時排除在外，這在某種程度上影響中國參與國際稅收征管合作的廣度和深度，制約中國參與國際稅收征管合作打擊國際逃避稅的影響力。

1.3 方法

1.3.1 細腳擬青霉RCEF4339培養方法

采用單因素試驗篩選細腳擬青霉RCEF4339原生質體制備的最優酶種類，酶濃度、酶解時間、酶解溫度、滲透壓穩定劑及pH。結果如圖1所示。結果顯示，最適最佳酶種類為溶壁酶、溶壁酶濃度2 mg/mL、酶解溫度32 ℃、pH 7.0、滲透壓穩定劑0.9 mol/L KCl。其中，由圖1-C可見，隨著酶解時間的延長，原生質體的生成量逐漸增加，當酶解時間超過3 h時，原生質體的生成量變化較小，因此，為了節省時間，細腳擬青霉原生質體制備的最佳酶解時間選擇3 h。

⑤汛期應服從防洪調度，同時兼顧水量的年際變化，每年九、十月份開始，應視河湖水情及上游來水情況逐步蓄水，必要時繼續抽江水補充湖庫，以保證冬春水量的正常供給。

再生培養基：葡萄糖40 g/L，酵母浸粉 10 g/L，蛋白胨10 g/L，0.9 mol/L KCl。

培養方法：50 mL搖瓶中裝入培養基20 mL，挑取PDA斜面保藏的菌株，于26 ℃恒溫振蕩培養箱(150 r/min)中培養5 d。活化菌種傳代3代后可以作為種子液使用。

1.3.2 細腳擬青霉孢子懸液制備方法

將活化好的細腳擬青霉接種于斜面培養基上，于26 ℃恒溫培養箱中培養7 d后，用無菌水沖洗斜面菌苔，獲得孢子懸浮液并將其放入帶有玻璃珠的無菌錐形瓶中，于26 ℃條件下振蕩30 min (150 r/min)。將經8層無菌紗布過濾的孢子懸液濃度稀釋至105個/mL，備用。

1.3.3 菌絲體的制備、原生質體制備及原生質體再生方法

菌絲體制備：取5 mL濃度為1×105個/mL的孢子懸液，接種至250 mL搖瓶中(裝液量為100 mL)進行菌絲體培養。培養條件為：培養溫度 26 ℃，轉速 150 r/min，培養時間 4 d。離心(5 000 r/min，8 min)處理發酵液，收獲菌絲體沉淀。

Y=15.603 3-1.453 3X1-5.920 0X2-1.680 0X3-2.696 7X4-3.130 0X5-0.386 7X6-2.630 0X7-1.730 0X8+0.313 3X9

評價一個模型的擬合度需參照其決定系數(R2)，軟件分析可得該多元一次回歸模型具有很高的決定系數(R2=0.988 9)，說明98.89%的響應值變化可通過上述模型加以解釋，擬合度較好。采用F檢驗分析表明該線性模型顯著(p=0.049)。依據回歸分析結果可知，在細腳擬青霉原生質體制備過程中，各考察因子的重要性依次為X2>X5>X4>X7>X8>X3>X1>X3>X6>X9。其中酶解時間(X2)、pH值(X4)和酶解溫度(X5)對響應值影響顯著(p<0.05)。其他因素的置信水平均低于95%，為不顯著項。

原生質體再生：用預冷的1.0 mol/L KCl溶液將原生質體液的濃度調整至5×102個/mL，取0.1 mL涂布于再生培養基上，26 ℃培養5 d，觀察并記錄單菌落數(A)。同時，取等量蒸餾水代替滲透壓穩定劑來稀釋等量原生質體，取0.1 mL于再生培養基上培養5 d，記錄單菌落數(B)。原生質體再生率的計算公式如下。

該工程混凝土的測溫分為熱電偶測溫和溫度計測溫兩種形式。溫度監測點的布置范圍為基礎澆筑體平面對稱軸線的一半區域為測試區，在測試區內監測點按平面層布置。測溫點沿混凝土澆筑體厚度方向，自上而下50 mm、800 mm、1 500 mm、2 200 mm、2 950 mm，共5層布置，即混凝土外表、底面、中心以及上中部、下中部測溫點，共計60個，其中24個熱電偶，36個測溫孔。另外，在混凝土外表面的養護膜內布置10個溫度測點，在大氣環境中布置氣溫測點2個，合計72個。測溫孔采用直徑Φ 50 mm的鋼管。

當然，老人最終也沒有成為小區物業的臨時工。在云夢對老人展開勸誡的同時，呼倫正在物業管理辦公室里展開談判。他提了滿滿一包禮物，他請求坐在辦公桌后面那位戴著眼鏡的中年男人千萬不要收下他的丈母娘。對方說可是我們已經收了押金，呼倫說押金好辦，不退也行。對方倒是通情達理，問清原因，痛快地將一百塊錢退還給呼倫。他送呼倫到門口，拍拍呼倫的肩膀，語重心長地說，回去對老人家好一點兒……老人在你那里過得肯定不怎么舒心。

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二是專業技能性實踐，主要培養學生專業操作技能和服務技能，同時培養學生職業意識。如目的地服務、飯店服務、在線旅行社服務、國家公園管理與服務等技能。這些技能以組織學生參與環境旅游解說規劃與服務、酒店管理、景區管理、旅游規劃設計實習等相關課程進行專項培養。專業技能性實踐的開展結合學生個人培養計劃，有針對性地進行開展，農林院校在學生專業技能性實踐的培養中突出農林文化、生態文化在個人培養目標中的內涵，如強調與森林保護、森林管理、森林公園規劃設計相關實踐課程的設置。專業技能性實踐的開展同樣是對課堂教學的補充，只有經過專業性技能的培養，才能充分驗證學生個人目標的可行性，并為今后學生職業規劃的方向指明道路。

自2015年李克強總理提出了“新舊動能轉換”以來，開始出現在國家領導人的講話和文件中，并在2016年開始頻繁出現在互聯網中。進入2017年以來，“新舊動能”的內涵才逐漸豐富和完善起來。所以“新舊動能”作為官方用語來說，沒有嚴格的概念界定，但我們從一系列政府文件中和領導講話中可以理解為：新舊動能轉換的實質就是經濟發展方式轉變的過程，是轉型升級的過程。在這個過程中，壯大新動能、提升傳統動能，推動經濟保持中高速增長、產業邁向中高端水平。在實施新舊動能轉換的經濟驅動下，我們職業及教育的教學模式也應該進行相應的轉換才能夠適應社會經濟的發展。

3天的對峙，案情沒什么進展，第三天晚飯后，王敬凱又坐到李桂明面前，以理解的口吻說：“你的案子我們公安已經查了幾次，雖然你恨張秋，但張秋丟小孩那天，你是不占有作案時間。可是，后來張秋在報紙上找小孩，你就沒做什么？沒有什么想法？比如說要弄倆錢花？”

1.3.4.1 單因素試驗

采用單因素試驗分別考察酶種類、酶濃度、酶解時間、酶解溫度、滲透壓穩定劑種類及其pH值對細腳擬青霉原生質體生成量的影響。具體地，按照上述原生質體制備工藝，分別采用2 mg/mL的纖維素酶、崩潰酶、溶壁酶和溶菌酶制備原生質體，尋找細腳擬青霉原生質體制備的最適酶種類。在此基礎上，對最佳酶(溶壁酶)的最適酶濃度、酶解時間、酶解溫度進行摸索。考察的溶壁酶濃度分別為0.5、1、1.5、2、2.5 mg/mL。溶壁酶酶解時間包括：1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 h。溶壁酶酶解溫度包括：28、30、32、34、36 ℃。此外，分別以0.6 mol/L的蔗糖、葡萄糖、山梨醇、NaCl、MgSO4·7H2O、KCl為原生質體制備的滲透壓穩定劑，配制酶解液，把菌絲體放入pH 5.5的酶解液中，30 ℃恒溫水浴，60 r/min酶解3.5 h，計算原生質體生成量，以尋找得到最佳的滲透壓穩定劑。在上述結果基礎上，調節滲透壓穩定劑的pH(5.0、6.0、7.0、8.0)，其他條件不變，制備原生質體，以分析pH值對響應值的影響。

1.3.4.2 Plackett-Burman設計試驗

依據上述實驗結果，采用9因子2水平的Plackett-Burman設計試驗篩選制備工藝中對細腳擬青霉原生質體生成量影響顯著的因素。Plackett-Burman設計試驗的考察因子及其編碼水平如表1所示。建立多元一次回歸方程擬合該試驗結果，并采用軟件Minitab 15對試驗結果進行回歸分析。采用軟件Minitab 15繪制Pareto圖以直觀分析6個考察因子對響應值的影響。

表1 Plackett-Burman設計試驗因子水平表Table 1 The levels of variables tested in Plackett-Burmanexperiment

1.3.4.3 Box-Behnken設計試驗

經Plackett-Burman設計試驗確定關鍵影響因素(酶解時間、pH和酶解溫度)后，采用3因子3水平Box-Behnken設計試驗進一步優化3個關鍵因素的最佳值，該試驗的因素及其水平如表2所示。建立多元二次回歸方程擬合Box-Behnken設計試驗結果，并應用響應面法分析各因素對原生質體生成量影響之間的交互作用。此外，采用人工神經網絡結合遺傳算法進一步分析該實驗結果[14]，以獲得細腳擬青霉的最佳原生質體制備工藝。

表2 Box-Behnken設計試驗的因子水平表Table 2 The levels of variables tested in Box-Behnkenexperiment

1.3.4.4 驗證試驗

采用最優的原生質體制備工藝進行5次平行驗證試驗，以確定所建模型和優化方法是否可靠和準確。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

培養基(g/L)：葡萄糖40，酵母浸粉10，蛋白胨10。

1.3.3 殼聚糖微球溶脹實驗 將所得殼聚糖微球分別置于pH2.0鹽酸溶液和pH7.0磷酸緩沖溶液中，每隔30 min測量微球的質量及粒徑大小.

圖1 單因素實驗結果Fig.1 The results of single-factor tests

2.2 采用Plackett-Burman設計試驗篩選對于細腳擬青霉原生質體生成量影響顯著的因素

實驗結果如表3所示。12組實驗中細腳擬青霉原生質體的生成量范圍(2.40～35.80)×106個/mL，變化較大，推測制備條件對細腳擬青霉原生質體生成量存在極強的影響。

采用Minitab 15軟件分析試驗結果，得到以下多元一次方程：

原生質體制備：稱取0.8 g細腳擬青霉菌絲體，采用滲透壓穩定劑清洗3次，然后重懸在滲透壓穩定劑配制并經微孔濾膜(0.22 μm)過濾除菌的酶解液(10 mL)中，30 ℃條件下振蕩(60 r/min)酶解一定時間；酶解結束后，將酶解液離心(800 r/min，2 min)，取上清離心(3 000 r/min，10 min)，取沉淀并用滲透壓穩定劑清洗3次，離心(3000 r/min，10 min)收集沉淀，并將所得沉淀重懸于滲透壓穩定劑中，即得純化的原生質體，在顯微鏡下觀察并用血球計數板計數，計算原生質體的生成率。

(2)

通過在安徽績溪壓力鋼管制造的實踐，鋼管圓度和焊接質量是小直徑高強度壓力鋼管制造的關鍵質量控制點。通過增加新型設備和新工藝的投入，不僅僅可以保證鋼管的制造質量，而且施工效率得到大幅提升，符合現階段節能環保的要求，施工成本也得到了有效的控制。

同時，采用Minitab 15軟件繪制Pareto和主效應圖，以進一步直觀分析各考察因子對于響應值影響的重要程度(圖2和圖3)。由該圖同樣可以清晰地反映出變量X4、X8、X9對細腳擬青霉原生質體生成量影響最為顯著。綜合以上結果分析可得，酶解時間(X2)、pH值(X4)和酶解溫度(X5)3個因素需要進一步優化，以確定其最佳的編碼值。

表3 Plackett-Burman 設計實驗方案及結果Table 3 The design matrix and results of Plackett-Burman experiment

圖2 各因子對響應值影響的Pareto圖Fig.2 Pareto chart describes the effect of factors on the response value

2.3 采用Box-Behnken設計試驗優化3個關鍵因素的最佳值

在上述試驗結果基礎上，采用3因子3水平的Box-Behnken設計試驗，進一步優化酶解時間、pH值和酶解溫度最佳值。試驗設計方案及相應的結果列于表4。按上述方法，本研究建立多元二次回歸模型擬合該試驗所得結果，并分別通過響應面分析法尋優。

采用軟件Minitab 15對所得數據進行響應面回歸分析，并通過一個多元二次回歸方程來擬合試驗結果，方程如下：Y=43.320 0+1.833 8×X1+0.338 8×X2-3.095 0×X3-13.927 5×X1×X1+1.260 0×X1×X2-8.847 5×X1×X3-22.892 5×X2×X2-0.477 5×X2×X3-8.785 0×X3×X3

(3)

圖3 各因子對響應值的主效應圖Fig.3 Main effects plot of independent variables on dependent variable

實驗號X1X2X3Y×106/(個·mL-1)實驗號X1X2X3Y×106/(個·mL-1)實驗號X1X2X3Y×106/(個·mL-1)1-1-108.24±0.2460-1113.2±0.3511-10117.36±1.292-1107.36±0.17701-111.04±0.27121019.60±0.9331-103.12±0.13801111.96±0.311300043.12±2.0641107.28±0.199-10-113.92±0.411400043.76±5.8850-1-110.37±0.331010-141.55±1.521500043.08±4.96

該回歸模型擬合度較好(R2=0.935 4)，預測值與實驗值二者間有較高的相關性。根據模型的p值(0.016 8)得出二次回歸模型顯著可靠。利用t檢驗分析模型中的各項因子的顯著性(表5)。其中，二次項(X12、X22、X32)對響應值的影響顯著(p<0.05)，可見3個變量與響應值之間不是簡單的線性關系。根據X1X3項的p值小于0.05，說明酶解時間對于細腳擬青霉原生質體生成量的影響與酶解溫度密切相關。三維的響應曲面圖以及二維的等高線圖可以更為直觀地顯示2因素間的交互效應(圖4)，與統計分析結果相一致。

表5 多元二次回歸模型統計分析結果Table 5 The statistical results of multiple quadraticregression model

此外，除了采用上述方法分析Box-Behnken設計實驗結果外，本研究還采用人工神經網絡ANN來擬合該實驗結果。從Box-Behnken設計試驗中隨機選擇兩組數據，分別作為預測集和測試集，剩余的實驗數據作為訓練集。隱含層結點數篩選結果如圖5所示，依據逼近度(Da)值可知該模型的最佳隱含層結點數為9。最優ANN模型的決定系數(R2)為0.973 4，說明該模型也具有較好的擬合度。訓練集、測試集和預測集的均方根誤差分別為0.010、0.012和0.015。在此基礎上，進一步利用遺傳算法GA方法優化這3個因素的最佳值。經過matlab軟件分析獲得這3個考察因素的最佳編碼值為:X1=0.206 3、X2=0.013 5和X3=-0.380 9，相應的實際值為：x1=3.4、x2=6.0和x3=28.0，預測最大原生質體生成量為4.41×107個/mL。綜合以上結果，可知優化得到的細腳擬青霉最佳原生質體制備工藝為：透壓穩定劑為0.9 mol/L的KCl緩沖液，溶壁酶酶解濃度2 mg/mL，酶解時間為3.4 h，酶解溫度為28.0 ℃，pH值為6.0。

圖4 各因素之間的響應面和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots showing the mutual effects between candidate variables and desirability value

圖5 隱藏結點數對逼近度的影響Fig.5 Effect of the number of hidden nodes on Da

2.4 驗證試驗

按照上述優化所得最優制備工藝制備細腳擬青霉原生質體，其5次平行試驗的平均原生質體生成量為4.40 ×107個/mL，與ANN模型預測結果間的誤差為0.23%。

1.1 資料來源 選擇2013年2月-2017年7月在本院住院和門診就診的妊娠孕婦3 920例，年齡21～40歲，平均年齡(27.23±2.31)歲；經產婦2 137例，初產婦1 783例；孕周16～41周，平均孕周(28.34±6.24)周。納入標準：自愿參與本次研究，并簽署知情同意書者；外院檢查疑似或確診有畸形者；早期有感冒病史；經引產或分娩證實為胎兒畸形。排除標準：合并妊娠糖尿病、妊娠期高血壓疾病等疾病者；存在胎兒宮內生長受限、臍繞頸、羊水異常等。本研究經我院倫理委員會審核并批準。

2.5 細腳擬青霉原生質體再生率測定結果

按照上述原生質體再生方法將制備所得原生質體涂布于再生培養基中，計算得到細腳擬青霉原生質體的再生率為31.25%。

3 結論

細腳擬青霉為高雄山蟲草的無性型，因其具有多種生物活性物質和多種藥理活性而受到廣泛關注，是我國一種重要的藥用真菌。核苷類化合物是該菌非常重要的一種生物活性成分[15]，其含量對于改善細腳擬青霉品質尤為重要。原生質體育種技術是微生物菌種選育的一種重要方法，而高效的原生質體是其應用的前提條件，其制備工藝受到很多因素的影響。雖然多種大型真菌已經成功制備出高效的原生質體，例如蛹蟲草、蝙蝠蛾擬青霉、桑黃等[16-18]，但是目前有關細腳擬青霉的研究多集中在發酵工藝優化、藥理及毒理等方面，有關細腳擬青霉的原生質體制備工藝的優化研究還未見相關報道。

為了解決這一問題并且簡化優化過程，本研究將多種化學計量學方法應用于細腳擬青霉原生質體制備工藝的優化研究中。化學計量學方法試驗方案設計合理，不僅可以考察多個因素對響應值的影響，還可考察因素間的交互作用。因而，與傳統的單因素試驗相比，應用化學計量學方法優化原生質體制備工藝試驗次數更少，結果更為可靠[19]。研究了多個因素對細腳擬青霉原生質體生成量的影響，獲得其最佳制備工藝為：滲透壓穩定劑為0.9 mol/L的KCl緩沖液，溶壁酶酶解濃度2 mg/mL，酶解時間為3.4 h，酶解溫度為28.0 ℃，pH值為6.0，按此條件制備細腳擬青霉原生質體，其生成量可達4.40×107個/mL。這為細腳擬青霉菌種改良及遺傳轉化系統的建立提供數據支撐。