二氨基庚二酸激活NOD1信號通路對心肌缺血再灌注損傷的影響

柳磊，張武，李召彬，李濱，徐貫杰，王園園，王金星

(1.河北醫科大學第三醫院 心臟外科，河北 石家莊 050051；2.安岳縣人民醫院 心血管內科，四川 資陽 642350； 3.河北醫科大學第三醫院 麻醉科，河北 石家莊 050051；4.河北醫科大學第三醫院 實驗中心，河北 石家莊 050051)

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

1.2 心肌缺血再灌注模型的建立

將40只C57/BL6雄性小鼠隨機分為4組，即假手術組、I/R組、DAP組和I/R+DAP組，每組10只。I/R小鼠模型按照徐多嬌等[9]所述的模型制作方式進行制作，麻醉后通過左胸廓切開術將心臟暴露并外露，將左前降支冠狀動脈(LAD)進行結扎，然后將心臟立即放回胸腔內，并進行關胸縫合。對假手術小鼠進行相同的手術操作，但只穿線不結扎。缺血30 min后，剪開結扎線，然后將心肌再灌注24 h。DAP組和I/R+DAP組小鼠在冠狀動脈結扎前30 min腹腔注射DAP(100 μg·只-1，生理鹽水稀釋)。假手術組和I/R組小鼠注射等劑量的生理鹽水。24 h再灌注后通過腹膜內注射三溴乙醇(1 mg·只-1)處死小鼠，獲取心臟組織。

1.3 實時定量R PCR

1.4 心肌梗死面積評價

1.5 免疫組化分析

1.6 細胞凋亡測定

1.7 蛋白質印跡分析

1.8 統計學處理

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據統計分析。計量數據以平均值±標準差表示，兩組間差異比較采用t檢驗，多組間的差異采用單因素方差分析(ANOVA)分析中的LSD檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 心肌缺血再灌注損傷對NOD1表達的影響

為了研究NOD1是否參與心肌缺血再灌注損傷，對小鼠進行30 min缺血和24 h再灌注。qPCR和蛋白質印跡分析顯示，與假手術組比較，I/R組NOD1 mRNA表達水平和NOD1蛋白水平顯著高于假手術組，差異具有統計學意義(P<0.05)，說明心肌缺血再灌注損傷顯著地增加NOD1 mRNA表達和NOD1蛋白表達(圖2)。

2.2 DAP激活NOD1對心肌梗死面積的影響

在缺血前對心肌缺血再灌注小鼠注射NOD1的激動劑配體DAP，再灌注24 h后測量梗死面積，結果顯示，I/R組梗死面積比值明顯高于假手術組，且I/R+DAP組小鼠梗死面積最高，差異具有統計學意義(表1)。

圖2假手術組與I/R組NOD1mRNA和蛋白的表達

由于DAP組與假手術組的危險區面積/左心室面積和梗死面積/危險區面積比值小于0.01，因此未在表中顯示，檢驗結果顯示DAP組與假手術組相比無顯著性差異。

表1I/R組與I/R+DAP組心肌梗死情況

組 別n(危險區面積/左心室面積)(梗死面積/危險區面積)I/R組100.12±0.010.58±0.07I/R+DAP組100.22±0.020.6±0.05t值4.1171.832P值0.0220.198

2.3 DAP激活NOD1對心肌細胞凋亡的影響

假手術組與DAP組的心肌細胞凋亡數量差異無統計學意義(P>0.05)。然而，在心肌缺血再灌注損傷24 h后，與假手術組相比，I/R組和I/R+DAP組TUNEL陽性細胞數顯著增加，I/R+DAP組陽性細胞數最多，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

圖34組小鼠心肌細胞凋亡情況

2.4 DAP激活NOD1對I 6炎癥反應的影響

2.5 DAP激活NOD1對N κB p65磷酸化的影響

3 討 論