人凝血酶原復合物中凝血因子活性測定的影響因素分析

陳華英，林偉華，洪 流，許景寧，高發平

（湛江中心人民醫院，廣東 湛江 524045）

歐洲藥典與英國藥典均明確規定，對于凝血酶原復合物，需測定凝血酶活性與激活凝血因子，以上兩項指標，最終目的是確保人體注射制品后降低血栓的發生率。人凝血酶原復合物（PCC），是一種具有促進血液凝固作用的靜脈注射血漿蛋白制劑，涉及有凝血因子（Coagulation factor，F）Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ，20 世紀60年代開始用于臨床，主要治療維生素K依賴的凝血因子缺乏癥、乙型血友病等[1]。近些年，諸多專家與學者不斷對其進行深入研究，且關于口服香豆素類抗凝劑過量快速逆轉的研究引起了醫學界的關注。自2011年以來，就國內而言，PCC短缺現象日漸嚴重，現如今，諸多廠家致力于研究PCC的制備工藝與臨床應用[2]。本文根據實踐，分析PCC中凝血因子活性測定的影響因素。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料（1）由華蘭公司提供的PCC。（2）由SIEMENS公司提供的 Coagulation factorⅡ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ Deficient Plasma。（3）來自SIEMENS公司的 Thromborel S、Actin、氯化鈣溶液。（4）FⅡ、FⅦ、FⅨ、FⅩ活性檢測試劑盒均由成都協和技術有限責任公司提供。（5）標準品1購自SIEMENS公司，標準品2購自NIBSC，標準品3購自成都協和技術有限責任公司。（6）Sigma p 4380硫酸魚精蛋白，其他試劑均為國產分析純。

1.1.2 儀器 法國STA-R Compact血凝分析儀，金壇市醫療儀器廠生產的HH-W600恒溫水浴箱，Millipore公司提供的Milli-Q Advantage純水儀。

1.2 方法

1.2.1 空白測定 取1支塑料杯置凝血儀中，添加0.1 ml缺血小板血漿，再添加0.1 ml腦磷脂，混合均勻，保溫2 min，再添加0.1 ml Tris緩沖液，添加0.1 ml 0.025 mol/L CaCl2，記錄凝固時間。凝固時間≥200 s，試驗成立，若＜200 s，表示試驗不成立。

1.2.2 樣品測定（1）硫酸魚精蛋白。以《中國藥典》（2010版）[3]為指導，使用相對應因子的乏漿（FⅨ用生理鹽水稀釋），對PCC制品進行稀釋處理，配制成0.2 mg/ml硫酸魚精蛋白溶液，根據歐洲藥典，判定肝素鈉于PCC中最大含量。用3種不同的方法處理PCC樣品。樣本1，添加一定濃度的硫酸魚精蛋白溶液，混合均勻后，馬上測定因子活性。樣本2，不添加硫酸魚精蛋白溶液。樣品3，添加濃度相同的硫酸魚精蛋白溶液，以37℃為準，將樣本2與樣本3進行15 min溫浴處理。隨后，應用全自動凝血儀對4種凝血因子的活性進行測定。

（2）鹽離子濃度。使用相應乏漿（涉及FⅡ、FⅦ、FⅩ）與生理鹽水（涉及FⅨ），稀釋PCC制品于一定濃度后，添加NaCl，其中，1 mol/L、0.5 mol/L、0.25 mol/L分別為制備鹽離子3個梯度的濃度，在保證PCC制品中凝血因子濃度達到中國藥典標準的前提下，測定凝血因子活性。

（3）標準品。采用3種不同的標準品，制作有效的標準曲線，依據中國藥典處理樣品，隨后，基于不同標準品，測定PCC中凝血因子活性。

（4）不同廠家試劑。采用2套不同廠家的試劑，按照中國藥典處理PCC制品后，測定樣品中的凝血因子活性。

1.3 統計學處理

用Excel錄入本次研究所涉及的所有數據，采用SPSS 20.0軟件，計數資料采用百分比（%）表示，進行χ2檢驗，計量資料用（±s）表示，進行 t檢驗，P＜0.05 表示有顯著性。

2 結果

通過調節腦磷脂稀釋度，達到空白時間≥200 s的要求，其中，腦磷脂，按照 1∶3 000 稀釋。

2.1 硫酸魚精蛋白

PCC制品添加硫酸魚精蛋白與不加的相比凝血因子活性偏低，但差異無顯著性（P＞0.05）。添加硫酸魚精蛋白后，有無給予37℃溫浴，對凝血因子活性并無顯著性影響。PCC制品添加硫酸魚精蛋白，相比不加，FⅨ活性偏高；加硫酸魚精蛋白后，馬上進行FⅨ活性測定，相比添加硫酸魚精蛋白且進行37℃溫浴活性更高，但差異并不顯著（P＞0.05），見圖 1。

2.2 鹽離子濃度

在3種不同鹽離子濃度下，所測得的FⅦ、FⅨ活性不存在顯著性差異（P＞0.05）。相比高鹽離子濃度，低鹽離子濃度下，所測得的FⅡ、FⅩ活性更高，差異具有顯著性（P＜0.05），見圖2。

圖2 不同鹽離子濃度對PCC中凝血因子活性的影響

2.3 標準品

對于FⅡ、FⅨ、FⅩ，不同標準品所測得的活性，標準品1＞標準品2＞標準品3；而FⅦ，則為標準品3＞標準品1＞標準品2，見圖 3。

2.4 不同廠家試劑

本次研究中，主要涉及SIEMENS公司與成都協和兩家的試劑，采用不同廠家試劑測定的凝血因子活性差異有顯著性（P＜0.05），見表 1。

3 討論

圖3 不同標準品對PCC中凝血因子活性的影響

表1 采用不同廠家試劑測定PCC中凝血因子活性的比較[±s，IU/ml]

表1 采用不同廠家試劑測定PCC中凝血因子活性的比較[±s，IU/ml]

廠家 FⅦ1.6±0.0 2.8±1.0 FⅡSIEMENS成都協和7.3±0.8 3.5±0.3 FⅨ4.1±0.6 3.1±0.4 FⅩ4.1±0.3 5.9±1.0

硫酸魚精蛋白是一種硫酸鹽，屬于堿性蛋白，于體內，中和肝素，導致肝素喪失抗凝活性[4]。從理論上講，硫酸魚精蛋白與肝素發生中和反應后，所測定的凝固時間呈縮減趨勢，凝血因子活性升高。本研究中，凝血因子活性卻下降，出現此結果，可能與過量使用硫酸魚精蛋白有關。硫酸魚精蛋白屬于弱抗凝劑，過量使用可降低凝血因子活性。因此，臨床檢測時，可先對PCC中肝素含量進行測定，為準確測定凝血因子活性提供保障。

實踐中，乏漿較昂貴，外源因子測定時，一般未嚴格遵照藥典實施操作，使用配套稀釋劑或純水，進行稀釋處理[5]。2005年版的《中國藥典》，明確規定FⅨ予以乏漿稀釋處理，而2010年版的《中國藥典》，規定采用生理鹽水予以稀釋，關于此變化的原因還需研究。

PCC生產工藝中多選用NaCl溶液、檸檬酸鈉作為洗脫劑，對于洗脫液，雖然予以了脫鹽處理，但還有些許NaCl殘留在PCC中，且濃度有所不同。因此，分析PCC中凝血因子活性受NaCl不同濃度的影響十分必要。就本次研究而言，在高濃度鹽溶液中凝血因子活性偏低，其中，在0.25 mol/L濃度下，相比其他2種濃度，FⅨ活性較低，但無顯著性差異。另外，不同標準品對PCC中凝血因子活性有一定程度的影響。本研究中，分別采用SIEMENS公司與成都協和的試劑，檢測顯示，PCC中凝血因子活性差異明顯，可見，不同廠家的試劑對PCC中凝血因子活性亦有影響。

綜上所述，在實際操作中，應綜合分析影響凝血因子活性測定的因素，采取行之有效的控制措施，減少干擾因素，保證測定結果的有效性。