利用青海湖裸鯉養殖廢水培養生物餌料的初步研究

段江南　蘇宏　王發艷　楊希

摘 要：利用青海湖裸鯉養殖廢水對小球藻進行培養，以及在開放條件下對小球藻生長趨勢進行研究，同時篩選土著淡水輪蟲品種，為生物餌料的研究提供基礎支撐。本研究以BG11標準培養基為基礎，在實驗室和室內開放條件下添加不同比例的養殖廢水，觀察小球藻的生長情況及水化學指標，將通過篩絹過濾得到的土著淡水輪蟲接種于小球藻內培養，定期用顯微鏡觀察輪蟲個體生長情況和數量等參數。結果表明：小球藻能夠較好地利用培養基中的氨態氮，添加魚塘水的培養基培養的小球藻前期長勢更好；室內開放條件下，小球藻的生長周期及生物量都明顯縮短；分離篩選得到的龜甲輪蟲和臂尾輪蟲能夠正常掛卵，但長期生長狀態還需進一步實驗研究。

關鍵詞：青藏高原；小球藻；輪蟲；葉綠素a；氨態氮

1引言

小球藻（Chlorella）為綠藻門小球藻屬普生性單細胞綠藻，具有豐富的多糖、脂質、蛋白質、葉綠素和一些生物活性物質，營養價值豐富，可作為天然水產餌料，改善水體化學環境條件，起到調節水質的作用，在水產飼料行業有著廣闊的應用前景，普遍見于淡水漁業生產[1]。尤其作為培養輪蟲的首選餌料，是淡水輪蟲大規模生產的重要因素之一[2]。使用小球藻培養輪蟲，可優化水質并且提高培養總量，也可以作為一種優質餌料用于輪蟲的大規模培養[3]。與天然水產餌料相比，輪蟲的蛋白質和粗脂肪含量均優于其它，在適口性、易得性、飼養效果方面都屬上等餌料[4-7]。另外，輪蟲具有適應性強、繁殖快、容易培養等特點，因而在水產行業多有應用 [8-10]。

在青藏高原水生動物養殖及物種與環境保護方面小球藻并未得到廣泛應用。高原特色物種青海湖裸鯉目前仍主要以雞蛋黃作為開口餌料，這種方法會導致成本偏高，在水體中投放量過多會造成水體污染，從而影響幼苗生長。為解決裸鯉開口餌料問題，本項目將小球藻作為輪蟲繁殖的主要營養物質，同時以后期大規模培養為目的，利用魚塘養殖廢水與基礎培養基的不同配比為實驗手段，探討適合小球藻大量快速生長的基本條件，為后期工廠化擴培小球藻提供實驗基礎與理論依據。

2材料與方法

2.1材料

實驗用小球藻購自中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫，篩選土著淡水輪蟲品種的水樣取自青海湖裸鯉救護中心原種場西二魚塘底層，養殖廢水取自青海湖裸鯉救護中心原種場西二魚塘。

2.2方法

2.2.1不同配比培養基中小球藻生物量的測定方法

通過葉綠素a的含量間接反映小球藻的生物量，測定培養基葉綠素a的含量，用移液槍吸取4 mL小球藻液置于10 mL離心管中，于12000 rpm離心5 min，棄去上清液，加入4 mL 80%丙酮重懸，4℃冰箱中放置過夜。將過夜重懸的藻液于12000 rpm離心5 min，將上清液轉移至比色皿中，以80%丙酮作為對照，用紫外分光光度計測定OD663、OD645值，根據下式計算葉綠素a含量，Ca（mg/L）=12.7OD663-2.69OD645。

2.2.2培養基中氨態氮的測定

向7支比色管中分別加入硫酸銨標準使用液0.00，0.10，0.20，0.40， 0.60，0.80，1.00 mL，加水稀釋至總體積10 mL，加A試劑、B試劑各1.25 mL（A試劑：5 g苯酚和25 mg二水合亞硝基鐵氰化鉀溶解、定容至100 mL；B試劑：2 mL次氯酸鈉溶液（NaClO）和2.5 g NaOH溶解、定容至100 mL）。于水浴鍋中50℃水浴20 min，冷卻，測定OD625，繪制標準曲線。水樣中氨態氮含量的測定：取水樣15 mL進行抽濾，得到過濾水樣，取10 mL過濾水樣放入比色管中，加入A試劑、B試劑各1.25 mL，于水浴鍋中50℃水浴20 min，冷卻，測定OD625，在標準曲線中查出氨態氮的含量。

2.2.3水樣初步處理及輪蟲篩選分離

將采集到的水樣攪拌均勻，使得水樣內物體漂浮。取得的水樣用80目篩絹進行過濾，用少量暴曬兩天的自來水將過濾在篩絹上的物體反復仔細沖洗1-2次，收集沖洗得到的水樣，用200目篩絹將水樣再次反復在同一200目篩絹上過濾，小心收集篩絹上所過濾得到的物體，用200 mL經暴曬的自來水充分沖洗至250 mL燒杯中。用膠頭滴管吸取1-2 mL燒杯中的水樣滴加到浮游生物計數框內置于光學顯微鏡下，先用4倍物鏡找到清晰視野觀察尋找輪蟲；找到后將物鏡擴大至10倍調焦至清晰，接著再將物鏡轉換為40倍調焦至清晰并用拍照留圖，之后利用吸嘴前端剪去2-3 mm的2.5 μL移液槍槍頭在顯微鏡下分離輪蟲。

3結果與分析

3.1不同配比魚塘水小球藻生物量及氨態氮含量分析

實驗結果表明，BG11/魚塘水為1：1和1：2的培養基，在1-9天內生物量明顯高于BG11培養基（P<0.05），在第9天達到峰值，葉綠素a含量分別為0.617 mg/L和0.710 mg/L，從第9天起進入衰亡期；BG11培養基葉綠素a含量在第24天達最大值1.097 mg/L，與初始葉綠素a含量相比增加0.991 mg/L，日平均生長量為0.041 mg/L，從第24天起進入衰亡期。以葉綠素a為縱坐標，以培養時間為橫坐標，繪制小球藻在不同培養基條件下的生長曲線，生長曲線見圖1。

小球藻對氨態氮的利用效果較好，三種培養基中氨態氮的初始濃度：1：2>1：1>BG11，且1：2培養基在第6天左右氨態氮含量達到最低值0.013 mg/L，1：1培養基在第9天左右氨態氮含量達到最低值0.034 mg/L，BG11培養基在第9天左右氨態氮含量達到最低值0.044 mg/L。從第10天起，可能存在硝態氮與氨態氮的轉化，培養基中的氨態氮含量均有所回升。培養基中氨態氮含量變化情況如圖2。

3.2室內開放培養與實驗室條件下小球藻生長情況的分析

室內開放培養中葉綠素a的初始含量為0.104mg/L，隨時間的變化為0～15 d上升，15 d后急速下降；實驗室條件下小球藻的葉綠素a初始含量為0.106 mg/L，隨時間變化經歷對數期、穩定期、衰亡期，培養周期明顯長于室內開放培養。

3.3顯微鏡下輪蟲的篩選分離

通過鏡檢可發現，青海湖裸鯉救護中心原種場西二魚塘水中生長有兩種不同的輪蟲，分別為臂尾輪蟲和龜甲輪蟲，鏡檢圖見圖3、圖4。分離過程中發現，臂尾輪蟲數量為1只/mL較龜甲輪蟲3只/mL少，但個體較大且活性及游動能力很強，未見有其卵存在；龜甲輪蟲屬于優勢種群，但個體較小且活性及游動能力很弱，有掛卵成蟲和卵團存在。

4討論

BG11/魚塘水為1：1與1：2小球藻的延滯期短，有可能是添加了魚塘水后有機質豐富，小球藻快速渡過了這一時期，但BG11/魚塘水為1：1與1：2小球藻的最大生物量和對數生長期不如BG11，可能是由于微量元素的差異。實驗表明小球藻對氨態氮的利用效果較好，BG11培養基在第9天左右氨態氮含量達到最低值0.044 mg/L。從第10天起，可能存在硝態氮與氨態氮的轉化，培養基中的氨態氮含量有所回升，由此可以看出，小球藻對氨態氮的吸收不是簡單的正比關系。

葉綠素a含量變化結合溫度變化可知，在室內開放條件下培養的小球藻與實驗室條件下培養的小球藻相比，前者的生長時期縮短20天左右，沒有延緩期，衰亡迅速，葉綠素a含量差異顯著，可能因為所在環境溫度不穩定，并且由于敞開培養導致外界生物進入培養體系，對其生長產生影響。

由于輪蟲具有生命活性，在浮游生物計數框內會保持游動狀態，因此顯微鏡下分離輪蟲時一定要保證目標輪蟲始終在視野范圍內，用處理過的2.5 μL微量移液槍迅速吸出輪蟲后完成轉移，轉移時應反復吹打移液槍，防止輪蟲粘在槍頭；用于培養輪蟲的小球藻濃度不易過高，保持在105個/mL即可，濃度過高會影響輪蟲生長，其原因一方面是小球藻過度生長繁殖造成培養瓶內養分與氧氣缺乏，影響輪蟲正常生長活動，另一方面是小球藻濃度過高會使取樣鏡檢輪蟲的難度增加，不利于觀察；通過鏡檢發現小球藻有可能被其他藻類污染出現大面積死亡，從而導致輪蟲生存環境受脅，說明實驗過程中培養液易被污染，以后再做此類實驗時盡可能保持無菌環境，生長培育實驗還需要進一步進行。

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作者簡介：

段江南（1993—），男，學士，就讀院校：青海大學。

楊希（1983-），通訊作者，博士，講師，主要研究方向：水生生物學。

基金項目：青海大學生態環境工程學院大學生科技創新項目（2016-S-3）