RP—HPLC法同時測定酶法合成阿莫西林工藝中的原料、中間體和產物的含量

李勝男

摘 要：本文采用高校液相測定了阿莫西林工藝中的原料、中間體和產物中6-氨基青霉烷酸、D-對羥基苯甘氨酸甲酯、D-對羥基苯甘氨酸、阿莫西林的含量，固定相為：瑞士Hamilton反相液相色譜柱 HxSil C18液相色譜柱（150*4.6mm，5un），乙腈-0.2M磷酸二氫鈉-0.2M磷酸氫二鈉（10：85：5）為流動相，檢測波長為230nm；此方法簡便、準確、重現性好，可用于阿莫西林工藝中的原料、中間體和產物中6-氨基青霉烷酸、D-對羥基苯甘氨酸甲酯、D-對羥基苯甘氨酸、阿莫西林的含量測定。

關鍵詞：阿莫西林；原料；含量

酶法合成技術始于20世紀60年代末70年代初，現在酶縮合反應技術、產品分離以及固定化酶技術等方面取得很大的發展，配套技術日益完善。酶法產品主要有產品含量穩定并且雜質低；酶法產品生產批量能夠達到化學法產品的2～3倍；有機溶劑的使用量大幅度減少90%，廢水排放減少80%等特點。本文采用高效液相法對阿莫西林工藝中的原料、中間體和產物中的6-氨基青霉烷酸、D-對羥基苯甘氨酸甲酯、D-對羥基苯甘氨酸、阿莫西林的進行了含量測定。

1 儀器與試藥

LC-2212型液相色譜儀（北京中科惠分儀器有限公司）；蘭博OV3000大容量柱溫箱（天津市蘭博實驗儀器設備有限公司）；和泰Master-S超純水機（自來水為水源）（上海和泰儀器有限公司）；BILON-1000C多用途恒溫超聲提取機（上海比朗儀器制造有限公司）；600220液相保護柱（天津琛航科苑科技發展有限公司）。乙腈（重慶躍翔化工有限公司）、磷酸二氫鉀（重慶躍翔化工有限公司）、三乙胺（重慶躍翔化工有限公司）、磷酸（天津市精強化工有限公司）醋酸乙酯（重慶躍翔化工有限公司）、甲酸（天津市精強化工有限公司）、乙醇（重慶躍翔化工有限公司）、乙酸銨（重慶躍翔化工有限公司）。6-氨基青霉烷酸、D-對羥基苯甘氨酸甲酯、D-對羥基苯甘氨酸、阿莫西林對照品自制。

2 含量測定

2.1 色譜條件：依據查閱文獻及考查的結果，確定色譜條件如下[1-5]。色譜柱為瑞士Hamilton 反相液相色譜柱 HxSil C18液相色譜柱（150*4.6mm，5un）；乙腈-0.2M磷酸二氫鈉-0.2M磷酸氫二鈉（10：85：5）為流動相；檢測波長為230nm；流速1.0mL·min-1；柱溫：30℃。理論板數按阿莫西林峰計算應不得低于2500。

2.2 供試品溶液的制備

取阿莫西林工藝中的原料、中間體和產物適量，精密稱取，置50mL棕色量瓶中，加流動相適量，超聲處理提取5分鐘，放置至室溫，加流動相稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45μm）濾過，即得。

2.3 對照品溶液的制備

取105℃干燥5小時的6-氨基青霉烷酸、D-對羥基苯甘氨酸甲酯、D-對羥基苯甘氨酸、阿莫西林對照品適量，精密稱取6-氨基青霉烷酸、D-對羥基苯甘氨酸甲酯、D-對羥基苯甘氨酸、阿莫西林對照品約10mg，置50mL棕色容量瓶中，用加流動相超聲溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得（每1mL溶液中含6-氨基青霉烷酸、D-對羥基苯甘氨酸甲酯、D-對羥基苯甘氨酸、阿莫西林0.2mg）。

2.5 標準曲線的制備

制備濃度為50、100、150、200、250、300、350、400μg·mL-1的6-氨基青霉烷酸、D-對羥基苯甘氨酸甲酯、D-對羥基苯甘氨酸、阿莫西林對照品溶液，分別精密吸取10μL注入HPLC，記錄色譜圖。以峰面積積分值A（μg）為橫坐標，進樣量為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。試驗表明，6-氨基青霉烷酸、D-對羥基苯甘氨酸甲酯、D-對羥基苯甘氨酸、阿莫西林對照品在50～400μg·mL-1范圍內線性關系良好。

2.6 精密度試驗

依照制備對照品溶液，精密吸取6-氨基青霉烷酸、D-對羥基苯甘氨酸甲酯、D-對羥基苯甘氨酸、阿莫西林對照品溶液10μL重復進樣6次，測定峰面積積分值，對照品峰面積積分值的RSD為0.86%，0.85%，0.86%，0.93%。結果表明，本實驗精密度良好。

2.7 重現性試驗

分別稱取同批樣品6份，分別依照2.2項下供試品制備方法制備供試品，按質量標準含量測定項下方法測定含量，并計算樣品的RSD值為0.75%，0.81%，0.79%，0.85%，結果表明，此含量測定方法的重現性良好。

2.8 穩定性試驗

依照供試品制備方法制備供試品溶液，分別在0，30，60分鐘精密吸取供試品溶液注入液相色譜儀，進樣測定，供試品6-氨基青霉烷酸、D-對羥基苯甘氨酸甲酯、D-對羥基苯甘氨酸、阿莫西林峰面積積分值的RSD為0.77%，0.76%，0.81%，0.85%。結果表明6-氨基青霉烷酸、D-對羥基苯甘氨酸甲酯、D-對羥基苯甘氨酸、阿莫西林至少在60分鐘內穩定。

2.9 回收率試驗

采用加樣回收試驗，取已知含量的同一批供試品各6份，精密稱定，分精密添加一定量的6-氨基青霉烷酸、D-對羥基苯甘氨酸甲酯、D-對羥基苯甘氨酸、阿莫西林對照品，按供試品制備所述方法制備供試品溶液，測定含量（同時測定樣品含量），計算回收率。6次測定的平均回收率為99.5%，99.3%，99.5%，99.3%，RSD為0.86%，0.79%，0.81%，0.78%。

3 討論

分別考察乙腈-0.2M磷酸二氫鈉-0.2M磷酸氫二鈉（10：85：5），乙腈-30mmol·L-1碳酸氫銨水溶液（含有0.7%氨水、0.1%三乙胺）線性梯度洗脫，乙腈-水（46∶54），乙腈-水-三乙胺（30：70：0.1）；0.2%三乙胺溶液（用磷酸調p H至5.3）-乙腈（65∶35）；甲醇-乙腈-甲酸-水（30：10：1：59）；不同比例的流動相，結果以乙腈-0.2M磷酸二氫鈉-0.2M磷酸氫二鈉（10：85：5）為流動相，供試品各峰分離效果最好，故選用乙腈-0.2M磷酸二氫鈉-0.2M磷酸氫二鈉（10：85：5）為流動相。

參考文獻

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