一株牛病毒性腹瀉/黏膜病毒株的分離與鑒定

范 娟，吳華偉，郎洪武，郝雪斌， 陳曉春，劉國英，高金源，趙麗霞，鄧 永，范秀麗

(1.揚州優邦生物藥品有限公司，揚州，225008 ；2.中國獸醫藥品監察所，北京，100081；金宇保靈生物藥品有限公司，呼和浩特，010030)

牛病毒性腹瀉/黏膜病(Bovine viral diarrhea/Mucosal Disease，BVD/MD)是黃病毒科瘟病毒屬牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)引起的以發熱、粘膜糜爛潰瘍、白細胞減少、腹瀉、咳嗽及懷孕母牛流產或產出畸形胎兒為主要特征的一種傳染病[1-2]。目前，該病在世界范圍內廣泛流行。我國于1983年首次分離到了BVDV[3]。近年來，流行病學調查表明我國牛、羚羊、鹿、豬等均不同程度的感染BVDV[1,4,5]，該病已嚴重影響著我國畜牧業的健康發展。本研究從云南某牛場疑似感染BVDV病例的牛腫大出血的腸系膜淋巴結和脾臟樣品中成功分離一株BVDV毒株，并對該病毒進行了病原學和分子生物學研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料和細胞 從云南省某牛場采集的疑似BVDV感染發病牛腫大出血的腸系膜淋巴結和脾臟，于滅菌MEM營養液中凍存，低溫運至實驗室；MDBK細胞和Vero細胞由中國微生物菌種保藏管理委員會獸醫微生物中心提供；綿羊睪丸細胞由中國獸醫藥品監察所提供。

1.1.2 毒種與血清 牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)標準毒株Oregon C24V株、BVD標準陽性血清和標準陰性血清，由中國微生物菌種保藏管理委員會獸醫微生物中心提供。

1.1.3 主要試劑 DMEM營養液為Gibco公司產品；胎牛血清為Hyclone公司產品；Ex-Taq酶為寶生物工程(大連)有限公司產品；Trizol為Invitrogen公司產品；IPTG、X-gal為北京索萊寶科技有限公司；低熔點瓊脂糖、中性紅溶液為Sigma公司；BVDV抗原檢測ELISA試劑盒為IDEXX公司產品；DNA凝膠回收試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司；T載體和感受態細胞為Tansgen公司；BVDV 間接免疫熒光試劑盒為中國微生物菌種保藏管理委員會獸醫微生物中心產品；抗藍舌病病毒(BTV)FITC結合熒光抗體為美國VMRD公司。

1.1.4 主要儀器 PCR儀(Biometra)、1500型酶標儀(Thermo)、電泳儀、紫外成像儀、倒置熒光顯微鏡(萊卡)等。

1.2 方法

1.2.1 病料的處理 將腫大出血的腸系膜淋巴結和脾臟混合樣品反復凍融3次，經組織研磨勻漿后，10000 r/min離心15 min，取上清，用孔徑為0.22 μm濾膜過濾除菌，將濾過液-70 ℃凍存備用。

1.2.2 病料的初步檢測 取1.2.1處理好的病料，按IDEXX BVDV抗原檢測ELISA試劑盒進行檢測和判定，檢測結果為BVDV陽性的病料用以病毒分離。

1.2.3 病毒的分離 將經1.2.2檢測結果為BVDV陽性的上清液3.0 mL，接種已長成單層的MDBK細胞培養瓶(75 cm2)，37 ℃吸附1 h，補加含2%胎牛血清的DMEM維持液(慶大霉素200 μg/mL、兩性霉素10 μg/mL)至30.0 mL，置37 ℃、5%二氧化碳的培養箱培養5日，每天觀察細胞病變。如此盲傳15代，如未出現細胞病變效應(Cytopathic Effect, CPE)，且經IDEXX牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒抗原檢測試劑盒和RT-PCR檢測結果均為陽性，則視為非致細胞病變型BVDV；如有CPE，則視為致細胞病變型BVDV。

1.2.4 病毒分離株的病毒含量測定 將1.2.3病毒株細胞F15代培養液，用不含血清的DMEM營養液進行10倍系列稀釋，取10-1～10-9九個稀釋度，每個稀釋度接種4孔已長成單層的96孔細胞板，每孔0.1 mL，37 ℃吸附1 h，補加2%胎牛血清的DMEM營養液培養5日，同時設正常細胞對照，采用間接熒光方法判定是否感染，按Reed-Muench法[6]計算TCID50。

1.2.5 純凈性檢測 按照《中國獸藥典》2015年版三部附錄方法分別進行無菌檢驗、支原體檢驗和外源病毒檢驗。

1.2.6 特異性檢測

1.2.6.1 鑒別試驗 將毒種用DMEM營養液稀釋為100 TCID50/0.1 mL，與等量BVDV特異性陽性血清混合，在37 ℃下中和作用1 h后，接種96孔板單層MDBK細胞各8孔，每孔100 μL，同時設立正常細胞對照和病毒對照各8孔。接種后在37 ℃下吸附1 h，再補加含2%新生牛血清的DMEM維持液100 μL，置37 ℃二氧化碳培養箱培養96 h，采用間接熒光抗體法判定結果。

1.2.6.2 間接熒光抗體檢測 按1.2.4方法培養72 h，棄去培養液，用80%冷丙酮乙醇溶液固定30 min，然后按照BVDV間接熒光試劑盒說明書進行熒光抗體檢測，倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6.3 RT-PCR檢測 根據BVDV國際標準毒株基因序列，在其最保守的5'端非編碼區序列設計合成一對引物，引物序列如下：

上游引物：5'-CATGCCCATAGT AGGAC-3'；

下游引物：5'-CCATGTGCCATGTACAG-3'。

引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成，預期片段為288 bp。

按病毒基因組RNA提取試劑盒說明，從分離毒株的細胞培養液和BVDV標準毒株Oregon C24V株細胞培養物中提取RNA。反轉錄合成cDNA反應體系為：AMV RT 5×Buffer 4 μL、dNTP(各2.5 mmol/L)2.5 μL、RNasin(40 U/μL)1 μL，反轉錄酶(5 U/μL)1 μL、下游引物(25 μmol/L)各1 μL、模板RNA 5 μL，補充DEPC水至20 μL，混勻后瞬離，42 ℃反轉錄60 min。PCR擴增反應體系為：模板cDNA 1 μL，Taq酶(5 U/μL)1 μl，dNTP(各2.5 mmol/L)1 μL，上游引物和下游引物(25 μmol/L)各1 μL，10×Buffer(含Mg2+)2.5 μL，補充DEPC水至25 μL，混勻后瞬離。PCR循環條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s， 50 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃ 5 min；最后4 ℃保溫。用1.5%瓊脂糖平板(溴化乙銨終濃度0.5 μg/mL)凝膠電泳檢測PCR擴增結果。

1.2.7 基因型序列測定 將1.2.6.3的 PCR產物目的片段的凝膠塊切下后，按商品化DNA凝膠回收試劑盒說明書進行DNA回收，克隆到pMD18-T載體上，送北京六合華大基因科技股份有限公司進行序列測定，然后與Genbank中已發表的30株BVDV毒株的5'端非編碼區序列使用MEGA軟件進行遺傳進化分析。采用的BVDV參考毒株信息見表1。

1.2.8 電鏡形態觀察 取F15代病毒培養物200 mL，反復凍融三次后10000 r/min離心30 min，取上清液50000 r/min離心5 h，棄上清液，沉淀物用0.5 mL去離子水溶解，用2%磷鎢酸鈉負染30 min，室溫下自然干燥后，在透射電鏡下觀察。

1.2.9 動物回歸試驗 選取BVDV抗原、BVDV 抗體均為陰性(血清中和抗體效價不高于1:4)的牛7頭，分為2組，1組2頭，1組5頭。將分離到的牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒細胞毒(病毒含量為103.0TCID50/mL)接種牛(5頭)，每頭牛接種10.0 mL(滴鼻腔左右各2.0 mL，滴口腔2.0 mL，頸部肌肉左右各注射2.0 mL)。同時設定2頭牛作為健康對照。兩組牛隔離飼養，攻毒后觀察14日，每日飼養、觀察，測定體溫(從攻毒前2日開始測定體溫)并采集深層鼻腔拭子接種MDBK細胞進行病毒分離，攻毒后14日剖殺作病理解剖學觀察。

表1 序列分析用BVDV參考毒株Tab 1 BVDV reference strains for sequence analysis

2 結果與分析

2.1 BVDV的分離 將IDEXX BVDV抗原檢測ELISA試劑盒檢測結果為陽性的腸道樣品接種MDBK細胞連傳15代，均未出現CPE(圖1)。將F1～F15代病毒培養物用IDEXX牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒抗原檢測試劑盒檢測均為陽性。將F15代細胞培養物進行PCR，結果為陽性(見圖2)。

A：BVDV F15代在MDBK上未產生CPE B：MDBK細胞對照A: None CPE appeared on MDBK cell infected with the 15th generation BVDV; B: Normal MDBK control

M：蛋白分子量標準；1: BVDV Oregon C24V株的PCR產物；2: BVDV F15代培養物的PCR產物; 3: MDBK細胞的PCR產物M：Protein Marker；1: PCR result of BVDV strain Oregon C24V;2: PCR result of the 15th generation BVDV;3: PCR result of MDVK cells

2.2 BVDV病毒含量測定 BVDV病毒分離物連傳15代，仍未出現CPE。將第5代病毒培養物收獲、凍融并分裝，經IFA病毒含量測定結果為104.5TCID50/ml。

2.3 純凈性檢測 按照2015年版《中國獸藥典》三部附錄方法進行無菌檢驗、支原體檢驗和外源病毒檢驗，結果為無菌生長、無支原體生長和無外源病毒污染，說明該分離毒株純凈性良好。

2.4 特異性檢驗

2.4.1 鑒別檢驗 將BVDV毒種稀釋為100 TCID50/0.1 mL后與等量BVDV標準陽性血清中和后接種MDBK細胞，經IFA染色未出現特異性熒光，BVDV病毒對照出現特異性熒光，正常細胞對照未出現特異性熒光(圖3)，說明分離的毒株為BVDV。

表2 F5代BVDV毒種外源病毒檢測結果Tab 2 Test of exogenous virus on 5th generation BVDV

A：中和樣品；B：病毒對照；C：細胞對照A: neutralized sample; B: Virus positive control; C: Normal cell control.

2.4.2 熒光抗體檢測 將分離的BVDV培養物在MDBK細胞上培養72小時，然后采用BVDV間接熒光試劑盒進行染色，在感染細胞的胞漿可觀察到典型的綠色熒光(圖4 A)，而細胞對照未出現綠色熒光(圖4 B)。

A：BVDV感染MDBK；B：MDBK對照A: Virus-infected MDBK cell；B: MDBKl cell control.

2.4.3 RT-PCR檢測 用設計的特異性引物，對分離培養物及BVDV Oregon C24V標準毒株進行RT-PCR擴增，發現分離培養物與BVDV 國際標準毒株Oregon C24V株均能擴增出288 bp的片段(圖5)，與預期目的片段一致，擴增結果清晰，無雜帶，而培養用MDBK細胞無任何條帶。

2.5 基因型序列測定 將所測的目的片段與Genbank中已發表的30株BVDV序列的5'端非編碼區序列進行同源性比較，同源性為68.7%～89.2%。其中與我國分離的BJ1202株(登陸號：KF925514.1)和Y2株(登陸號：KY964311.1)同源關系最近，均為89.2%。與BVDV I型經典毒株Oregon株、Singer株、NADL株的同源性為83.8%～86.9%(圖6)，與BVDV 2型經典毒株890株同源性僅為73.4%；與2014年以來我國北京、吉林、四川、山東等地分離的BVDV 毒株親緣關系在88%左右。基因序列系統進化樹分析結果顯示同樣的結果(圖7)。

2.6 電鏡形態觀察 BVDV分離株細胞培養液經離心濃縮，負染，電鏡下觀察發現，病毒離子略呈圓形，有囊膜，直徑約40～60 nm。

M: 蛋白分子量標準；1: BVDV Oregon C24V株的PCR產物;2: BVDV分離株的PCR產物; 3: MDBK細胞的PCR產物;M: Protein Marker; 1: PCR result of BVDV strain Oregon C24V;2: PCR result of BVDV strain;3: PCR result of MDBK cell.

圖6 BVDV/W株與Genbank中BVDV基因序列進行同源性比較Fig 6 Homology analysis between BVDV/W and the sequences from GenBank

圖7 BVDV W株與Genbank中BVDV基因序列系統進化樹Fig 7 Phylogenetic analysis of BVDV/W and sequences from GenBank

圖8 BVDV/W株電鏡照片Fig 8 The electronic microscope photo of strain BVDV/W.

2.7 動物回歸試驗結果 將BVDV分離毒株接種陰性敏感牛，從臨床觀察癥狀看，攻毒后第3日開始有3頭牛陸續出現典型的腹瀉癥狀(稀便，嚴重時甚至呈水樣)，3頭牛的口腔、鼻腔、陰道、肛門或眼結膜等黏膜組織出現充血或潰瘍等癥狀，2頭牛的鼻腔或眼睛還伴有黏液性或膿性分泌物，發病牛精神沉郁、食欲減退；出現腹瀉的3頭牛體溫升高到40 ℃以上，最高可達到41.6 ℃，其中2頭均持續高溫2日以上。另外的2頭牛體溫未見異常，但伴有漿液性或膿性眼鼻分泌物。1頭牛連續腹瀉后第10日死亡。對照牛未見任何異常。從攻毒牛鼻拭子病毒分離情況看，攻毒后有3頭牛從攻毒后第5～8日開始向外排毒，可持續至第10～14日(1頭持續至14日)，2頭牛僅攻毒后5～6日和5～7日可檢測到病毒。

3 討 論

據可否使培養細胞產生細胞病變，可將BVDV分為兩種生物型[1-2]：一種為病毒在細胞中復制不引起細胞病變，稱為非致細胞病變型(Noncytopathogenic,NCP)，如NY-1株；另一種為引起細胞形成空泡、核固縮、溶解和死亡等病變，稱為致細胞病變型(Cytopathogenic,CP)，如OregonC24V株、NADL株等。NCP型能引起持續感染，CP型BVDV在體內不能引起持續感染。從國內外已批準的BVDV弱毒疫苗和滅活疫苗(包括含BVDV 成分的二聯或多聯疫苗)看，僅有4個疫苗為NCP生物型，其余均為CP型[7]。本研究利用MDBK細胞，成功從疑似感染BVDV牛腫大出血的腸系膜淋巴結和脾臟樣品中分離出1株BVDV，該毒株在MDBK細胞上連傳15代，均不產生CPE，證明該分離毒株為NCP型。從動物回歸結果看，該分離毒株接種健康易感牛，可引起體溫升高(超過40 ℃)、腹瀉、黏膜病、眼鼻黏性或膿性分泌物等典型BVD癥狀，從而進一步證明分離到的毒株為BVDV。

BVDV 5'-UTR在BVDV基因組中相對保守的，常用作合成引物來檢測BVDV或作為BVDV分型鑒定引物[8-9]。根據5'-UTR的序列可將BVDV分為BVDV-1和BVDV-2兩種基因型，但這兩種基因型均屬于同一個血清型，存在一定的交叉保護[10-11]。Fei Xue等[12](2010)研究表明：目前我國流行優勢株以BVDV-1型為主。本研究根據國際標準毒株的5'-UTR序列設計出特異性引物，經PCR反應可擴增出288bp特異性條帶，并經5'-UTR序列分析，與我國分離的BJ1202株(登陸號：KF925514.1)和Y2株(登陸號：KY964311.1)同源關系最近，均為89.2%，與2014年以來我國北京、吉林、四川、山東等地分離的BVDV毒株親緣關系在88%左右。系統進化樹也顯示分離的毒株與國內主要流行分支相同，均屬于BVDV-1型。說明該毒株具有一定的代表性。

BVD的根除方法是病畜的檢驗與捕殺，但成本較高。疫苗接種是目前多數國家控制和預防該病的主要方法，常規滅活疫苗和活疫苗是主要的疫苗類型[13]。弱毒疫苗雖可刺激機體產生較高滴度的抗體，但其存在毒力不穩定，可誘發免疫抑制、持續感染以及可能存在外源病原污染等安全隱患。相比較而言，滅活疫苗安全性方面的優勢更為明顯，并且其免疫原性相對較差的缺點可通過選用有效的佐劑加以改進。針對目前BVD較為嚴重的流行形勢，采用流行優勢毒株制備安全高效的滅活疫苗應為防控這BVD的首選。 因此，本研究所分離到的BVDV/W株具有開發滅活疫苗的潛力。