HPLC法同時測定磺胺二甲嘧啶含量和泰樂菌素組分

任玉琴 ，裘丞軍，吳望君

(浙江省獸藥飼料監察所, 杭州 311199)

泰樂菌素屬于大環內酯類抗生素，主要用于敏感菌引起的畜禽各種革蘭氏陽性菌、支原體感染，磺胺二甲嘧啶為磺胺類抗菌藥，為廣譜抑菌劑。泰樂菌素和磺胺二甲嘧啶制成的復方制劑，在作用機理上具有累加作用，主要用于治療畜禽革蘭氏陽性菌和支原體感染，也用于預防豬痢疾[1]，市場上應用最早的為“磷酸泰樂菌素、磺胺二甲嘧啶預混劑”[2]，被收載于《進口獸藥質量標準》1999年版，“酒石酸泰樂菌素、磺胺二甲嘧啶可溶性粉”[3]作為地方標準上升到國家標準，被收載于《獸藥國家標準匯編》第一冊(獸藥地方標準上升國家標準)，該產品也是我國獸藥企業生產較多的一個品種，獸藥國家標準匯編中，泰樂菌素含量采用生物效價法測定、組分采用高效液相色譜(HPLC)法測定，磺胺二甲嘧啶(SM2)含量采用紫外-可見分光光度法測定，方法繁鎖。磺胺類結構中均存在共軛雙鍵，在紫外區有吸收，特別是SM2與磺胺嘧啶有相同的官能團，用紫外-可見分光光度法測定含量和最大吸收波長作為鑒別，專屬性不強。在動物源性食品中SM2殘留測定均采用HPLC或LC/MS-MS法測定[4-6]，陶彌峰[7]建立了液相色譜法測定營養品中磺胺類的殘留；徐恩民[8]等對氟苯尼考制劑中SM2等測定進行了研究；包潔華[9]等用HPLC法測定酒石酸泰樂菌素有關物質的研究；HPLC法測定磺胺二甲嘧啶和泰樂菌素[10-12]已在各個領域得到應用。為此本文對泰樂菌素組分、磺胺二甲嘧啶含量的測定方法進行研究，建立了用HPLC法同時測定磺胺二甲嘧啶和泰樂菌素組分含量，方法簡便、快速，專屬性強。

1 材 料

1.1 試劑和藥品 市售酒石酸泰樂菌素、磺胺二甲嘧啶可溶性粉，批號：13022501、20140301、14030601；泰樂菌素標準品，中國獸醫藥品監察所，批號K0161305；磺胺二甲嘧啶對照品，批號：H0371008，含量99.8%，中國獸醫藥品監察所；磺胺間甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺氯吡嗪鈉、磺胺喹噁啉、磺胺甲噁唑對照品來源于中國獸醫藥品監察所；磺胺氯噠嗪鈉、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺噻唑、磺胺脒、磺胺甲氧噠嗪對照品均來源于Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

1.2 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀；Agilent 1260高效液相色譜儀；Waters2690高效液相色譜儀；UV-2550紫外分光光度計；Mettler Toledo電子天平。

2 方法和結果

2.1 磺胺二甲嘧啶含量測定方法學建立

2.1.1 液相色譜條件 以ECOSIL C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)為色譜柱；流動相：2 mol/L高氯酸鈉溶液(用1 mol/L鹽酸溶液調pH至2.5±0.1)-乙腈，采用梯度洗脫方法(表1)；流速1.0 mL/min；檢測波長280 nm；進樣量20 μL。

表1 流動相梯度洗脫程序Tab 1 Mobile phase gradient elution program

2.1.2 標準溶液配制 取磺胺二甲嘧啶對照品適量，加0.1 mol/L HCl溶液溶解制成20 μg/mL溶液；取泰樂菌素對照品約35 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇10 mL溶解，用水稀釋刻度，將磺胺二甲嘧啶與泰樂菌素標準溶液混合，按上述色譜條件測定，結果磺胺二甲嘧啶和泰樂菌素4個組分有較好的分離，泰樂菌素D峰與A峰的分離度≥3.2；泰樂菌素C峰與磺胺二甲嘧啶分離度≥30(圖1)。

2.1.3 檢測波長篩選 取2.1.2項下的標準溶液，在200～400 nm波長進行掃描，結果磺胺二甲嘧啶在243 nm處有最大吸收、在300 nm處有次吸收，酒石酸泰樂菌素在300 nm波長處有最大吸收，2010版《中國獸藥典》[13]酒石酸泰樂菌素組分檢測波長為280 nm，美國藥典(USP)[14]和歐州藥典(EP)[15]標準中泰樂菌素組分檢測波長均為290 nm，因此選擇280 nm、290 nm進行考察。

按擬定的色譜條件，采用雙波長測定，結果磺胺二甲嘧啶在280 nm處的響應值略高于290 nm，泰樂菌素C、B、D、A組分在290 nm的響應值略高于280 nm，因此本方法檢測波長選擇280 nm，與《中國獸藥典》一致。

圖1 磺胺二甲嘧啶和酒石酸泰樂菌素混合標準溶液色譜圖素Fig 1 Chromatograph of sulfadimidine and tylosin tartrate standard mixture

C2.1.4 磺胺二甲嘧啶定量限和檢測限考察 取磺胺二甲嘧啶標準溶液(2.1.2項)適量，用水稀釋成不同的上機濃度，按上述色譜條件上機分析，結果上機濃度為0.05 μg/mL ,其S/N=3.9；上機濃度為0.15 μg/mL ,其S/N=13，磺胺二甲嘧啶檢出限為0.05 μg/mL：定量限0.15 μg/mL，見圖2、圖3。

2.1.5 磺胺二甲嘧啶線性考察 取磺胺二甲嘧啶對照品約20 mg，置50 mL量瓶，加0.1 mol/L HCl溶解至刻度，搖勻，精密量取適量，用水稀釋成濃度為10、20、40、80、160、200 μg/mL的上機液，按上述色譜條件進行分析，結果線性方程：y=48.618X-63.982，R2=0.9994，在10～200 μg/mL濃度范圍內具有良好的線性。

圖2 磺胺二甲嘧啶檢出限(S/N=3.9)Fig 2 Tylosin limit of detection (S/N=3.9)

圖3 磺胺二甲嘧啶定量限(S/N=13)Fig 3 Tylosin limit of quantitation(S/N=13)

2.1.6 磺胺二甲嘧啶準確度與精密度試驗 模擬“酒石酸泰樂菌素、磺胺二甲嘧啶可溶性粉”處方：10%酒石酸泰樂菌素+10%磺胺二甲嘧啶+10%無水碳酸鈉，用無水葡萄糖加至100%。按處方量的80%、100%、120%添加磺胺二甲嘧啶、酒石酸泰樂菌素，進行加標回收試驗。每一濃度制備4～5份，分別置50 mL容量瓶，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置50 mL容量瓶，用水稀釋至刻度，搖勻；另稱取磺胺二甲嘧啶對照品9.75 mg，置50 mL容量瓶，加0.1 mol/L HCL溶液溶解至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置50 mL容量瓶，用水稀釋至刻度，搖勻。按上述色譜條件進行分析，精密量取20 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算，試驗結果見表2。

表2 磺胺二甲嘧啶準確度與精密度試驗結果Tab 2 Accuracy and precision of tylosin measurements

上述試驗結果表明，磺胺二甲嘧啶含量測定平均回收率在99.7%～100.1%間，RSD為0.3%～0.5%，方法的準確度和精密度均滿足要求。

2.1.7 磺胺二甲嘧啶含量測定上機液放置穩定性試驗 取批號為14030601 、13022501和20140301樣品，加0.1 mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取適量，用水定量稀釋制成每1 mL中約含磺胺二甲嘧啶0.08 mg/mL的溶液，按上述色譜條件，放置不同時間重復測定，結果磺胺二甲嘧啶峰面積變化極小，該方法中溶液非常穩定(表3)。

表3 含量測定溶液放置穩定性試驗Tab 3 Sample stability test

2.1.8 方法專屬性試驗

2.1.8.1 磺胺類產品干擾試驗 《中國獸藥典》2010年版共收載了磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺氯吡嗪鈉、磺胺喹噁啉、磺胺甲噁唑、磺胺氯噠嗪鈉、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺噻唑、磺胺脒、磺胺甲氧噠嗪11種磺胺類產品，取上述對照品適量，加0.1 mol/L HCl溶液溶解制成20 μg/mL溶液；另取泰樂菌素對照品約35 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加甲醇10 mL溶解，用水稀釋刻度。

取混合標準溶液按上述色譜條件測定，結果磺胺二甲嘧啶與另10種磺胺類、泰樂菌素4個組分均能有效分離，見圖4。混合標準溶液組分出峰順序依次為：磺胺脒、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧噠嗪+磺胺對甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺氯吡嗪、磺胺喹噁啉、泰樂菌素C、泰樂菌素B、泰樂菌素D和泰樂菌素A。

圖4 酒石酸泰樂菌素和11種磺胺混合標準溶液色譜圖Fig 4 Chromatograph of tylosin tartrate and sulfonamides standard mixture

2.1.8.2 酸降解試驗 取酒石酸泰樂菌素與11種磺胺類對照品約15 mg，置25 mL容量瓶，加0.1 mol/L鹽酸溶液至刻度，放置2.5 h，用NaOH溶液調pH值至中性，按上述色譜條件上機測定，結果酒石酸泰樂菌素在酸性環境中降解明顯，磺胺二甲嘧啶與各降解峰分離良好，見圖5。

圖5 酸降解后酒石酸泰樂菌素和磺胺類混合標準溶液色譜圖Fig 5 Chromatograph of sulfonamides standard mixture and tylosin tartrate after acid hydrolysis

2.1.8.3 堿降解試驗 磺胺二甲嘧啶在堿性條件下較穩定，因此本方法僅對酒石酸泰樂菌素進行堿降解試驗。取酒石酸泰樂菌素對照品約15 mg，置25 mL容量瓶，加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液至刻度，放置5 h，用HCL溶液調pH值至中性，按上述色譜條件分析，結果酒石酸泰樂菌素在堿性環境中降解徹底，各降解峰對磺胺二甲嘧啶峰無干擾，見圖6。

圖6 酒石酸泰樂菌素堿降解色譜圖Fig 6 Chromatograph of tylosin tartrate after alkaline hydrolysis

2.1.8.4 氧化破壞試驗 取批號為13022501樣品約0.2 g，加30%過氧化氫溶液5 mL，放置3 h，加水至25 mL，按上述色譜條件分析，結果酒石酸泰樂菌素主峰全部降解，各降解峰與磺胺二甲嘧啶主峰分離良好(圖7、圖8)。

圖7 批號13022501樣品溶液色譜圖Fig 7 Chromatograph of Sample 13022501

圖8 批號13022501樣品氧化破壞色譜圖Fig 8 Chromatograph of Sample 13022501 after oxidation

2.1.9 方法耐用性考察 取2.1.2項下的溶液，按上述色譜條件，通過不同品牌的色譜柱，小幅改變流動相比例、柱溫及不同液相色譜儀，考察該色譜條件的耐用性，結果磺胺二甲嘧啶與泰樂菌素分離度、峰面積未受影響，該方法有較好的重現性。

2.2 泰樂菌素組分測定

2.2.1 按擬定的方法測定 取樣品約0.35g與泰樂菌素對照品約35 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加甲醇10 mL溶解，用水稀釋刻度，照2.1.1項下的色譜條件試驗，以泰樂菌素標準品溶液中C、B、D、A主組分峰定性供試品溶液的主組分峰，按峰面積歸一化法(除磺胺二甲嘧啶峰外)計算，結果泰樂菌素D峰與泰樂菌素A峰的分離度≥3.2；泰樂菌素C峰與磺胺二甲嘧啶分離度R≥30，泰樂菌素A峰拖尾因子0.93；理論板數按泰樂菌素A計算為20507，系統適應性試驗均符合要求，樣品考察結果該色譜條件有較好的重現性。結果見表4。

2.2.2 按《中國獸藥典》方法對泰樂菌素組分定性考察 取泰樂菌素標準品適量，按《中國獸藥典》2010年版方法制備上機溶液和測定，結果泰樂菌素C、B、D、A組分的相對保留時間為0.49、0.76、0.82、1，而標準品附帶的色譜圖中相對保留時間為0.61、0.72、0.8、1， C、B、D組分與《中國獸藥典》規定的0.5、0.7、0.8有一定的出入。

表4 泰樂菌素組分檢查結果Tab 4 Tylosin component test results

3 討論與結論

通過酸、堿、氧化破壞、同類產品的干擾試驗及方法耐用性考察，結果顯示11種磺胺類產品和泰樂菌素組分在該色譜條件中有較好的專屬性和重現性。該方法的建立，能同時完成磺胺二甲嘧啶含量和泰樂菌素組分測定，方法簡便、準確、專屬性強，能有效甄別其他磺胺類成分的非法添加，為產品質量控制提供較好的技術支持。

《中國獸藥典》收載了眾多的泰樂菌素系列產品，均采用相對保留時間來定位C、B、D、A組分，但在實際操作中，不同品牌、不同規格色譜柱影響組分的相對保留時間，定位有一定難度，給檢測結果的準確性帶來影響。USP 36版也采用相對保留時間來定位泰樂菌素組分，EP 7.0版采用對照品C、B、D、A組分定性樣品中組分，目前泰樂菌素標準品附帶含C、B、D、A組分色譜圖，用泰樂菌素C、B、D、A組分對照品來定性樣品中的組分能有效解決當前組分定性的不準確。