復(fù)方茵陳保肝口服液的制備與提取工藝研究

陳容，羅 亮，李秋萍，張瀘月，曾 杰，李霞輝，舒 剛

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，四川成都 610000)

肝臟是動物體具有消化、解毒、免疫等重要功能組織器官。蛋雞脂肪肝又稱脂肪肝綜合征或脂肪肝出血性綜合征[1]，是產(chǎn)蛋雞常見的一種營養(yǎng)代謝性疾病。主要是脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)過分堆積，影響肝臟的正常功能，嚴(yán)重的甚至引起肝細(xì)胞破裂，最終導(dǎo)致肝內(nèi)出血而死亡。患脂肪肝的雞群很難出現(xiàn)產(chǎn)蛋高峰，產(chǎn)蛋率一般上升到85%左右即開始逐漸下降。而蛋類需求在我國這樣畜禽大國較大。中醫(yī)稱脂肪肝為肝癖，在長期的實(shí)踐中，積累了豐富的治療脂肪肝的經(jīng)驗(yàn)[2]。中藥口服液是當(dāng)前中藥生產(chǎn)中新興的，由中藥湯劑為基礎(chǔ)發(fā)展而來的熱門劑型。具有起效快、作用明顯、方便攜帶、便于保存等優(yōu)點(diǎn)[3]。復(fù)方茵陳保肝口服液全方由茵陳、黨參、柴胡、熟地、淫羊藿、益母草、牛膝七味中藥組成，具有清熱解毒、活血化淤、滋養(yǎng)肝臟以及強(qiáng)筋補(bǔ)腎、益氣養(yǎng)精之功效[4-6]。香豆素[7]是君藥茵陳中含有的主要成分，可以抑制肝臟中凝血因子的合成，具有明顯保肝作用。后期的動物實(shí)驗(yàn)中證明復(fù)方的口服液對禽類鵪鶉脂肪肝有防治作用。本研究采用多因素分析與正交試驗(yàn)法，以濱蒿內(nèi)酯為對照品，通過紫外分光光度法測定口服液中香豆素的含量，以其含量高低作為優(yōu)選口服液制備工藝的標(biāo)準(zhǔn)。選取料液比、煎煮時(shí)間、醇沉?xí)r間為多因素，先分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)，優(yōu)選出每個(gè)因素最佳水平后，以最佳水平及其相鄰的兩個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)法選出口服液最佳提取工藝。口服液制備工藝研究完成后，采用薄層色譜法對口服液中茵陳、黨參、淫羊藿進(jìn)行定性鑒別，并利用高效液相色譜法準(zhǔn)確測定口服液中香豆素的含量，以此建立口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 材 料

1.1 主要藥品 茵陳、黨參、柴胡、熟地、淫羊藿、牛膝、益母草(七種藥材均購于四川成都溫江惠明路211號惠民大藥房)、苯甲酸鈉、苯甲酸、蒸餾水、NaOH、乙醇、甲醇、硫酸、乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙腈、濱蒿內(nèi)酯對照品(中國藥品生物制品檢定所，1511-200001批號)、茵陳對照藥材(中國藥品生物制品檢定所，21555-201101批號)、黨參對照藥材(中國藥品生物制品檢定所，10766-20041批號)、淫羊藿苷對照品(中國藥品生物制品檢定所， 110737-200405批號)

1.2 主要儀器 燒杯、錐形瓶 、玻璃棒 、過濾漏斗、比色皿、UV1100型紫外可見分光光度計(jì)(上海天美科學(xué)儀器有限公司)；BP211S型電子分析天平(北京Sartorius天平有限公司) 、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、1XC-110A型超聲波清洗器(濟(jì)寧鑫欣超聲電子設(shè)備有限公司)、恒溫水浴鍋(余姚市亞星儀器 儀表有限公司)、紫外分析儀(鄭州豫華儀器制造有限公司)、HP1100型高效液相色譜儀(美國惠普公司)、硅膠G薄層板(青島海洋化工廠)

2 方法與結(jié)果

2.1 優(yōu)選口服液制備工藝

2.1.1 處方 茵陳6 g、黨參6 g、柴胡4 g、熟地4 g、淫羊藿4 g、牛膝2 g、益母草2 g。

2.1.2 基本制備工藝 取上述七味中藥在1000 mL大燒杯中加10倍的蒸餾水浸泡30 min，煎煮2次，每次煎煮1 h。待藥液冷卻至室溫后，用漏斗濾過，合并兩次濾液。隨后置于離心機(jī)離心10 min，取出上層濾液，棄去殘?jiān)瑢﹄x心后的濾液進(jìn)行濃縮，使藥液濃縮至相對密度1.02～1.05 g/mL即可。待濃縮液冷卻后向其中加入95%的乙醇使其藥液里的乙醇濃度達(dá)到60%[4]，進(jìn)行醇沉，攪拌均勻后放置5 ℃冰箱靜置24 h。取出上清液過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中回收濾液中的乙醇。向回收乙醇后的藥液中加入蒸餾水使藥液達(dá)到28 mL。向藥液中加入0.1 g的苯甲酸鈉和0.1 g苯甲酸，攪拌均勻，用0.2%NaOH調(diào)pH值使藥液pH值在5～7之間。最后將所制的28 mL的藥液進(jìn)行分裝，滅菌，即可[8]。

2.1.3 含量測定方法 利用濱蒿內(nèi)酯為對照品，用紫外分光光度法在340 nm處測定口服液中香豆素含量[9]。本研究隨機(jī)選取料液比為1∶16，煎煮時(shí)間為1.5 h，乙醇濃度為60%，按照制備工藝制成的口服液作為樣品，對測定方法進(jìn)行考評，結(jié)果表明該方法簡單易行，重復(fù)性好，可用于本研究的工藝優(yōu)化。

對照品溶液的制備：精密稱取濱蒿內(nèi)酯6.8 mg，置100 mL量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度線，搖勻即得。

供試品溶液的制備：精密量取樣品1 mL置100 mL量瓶中，加 70%乙醇稀釋至刻度, 搖勻即得。

線性關(guān)系的考察：精密量取對照品溶液 1、 2、 3、 4、 5、 6 mL，分別置 25 mL量瓶中，加 70%乙醇稀釋至刻度，搖勻[10]。以 70%乙醇為空白，照紫外-可見分光光度法(《中國藥典》 2015年版四部通則)，在340 nm的波長處測定吸光度，以吸光度(Y)為縱坐標(biāo), 濃度(X)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[11]。 得回歸方程為Y=0.0597X-0.008，r=0.9998。結(jié)果表明，濱蒿內(nèi)酯在2.72～16.32 μg/mL與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn)：取稀釋后的對照品溶液(濃度：10.88 μg/mL)，在340 nm處連續(xù)測定6次吸光度。結(jié)果RSD為0.84%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品溶液， 在340 nm處于0、1、 2、3、4 h測定其吸光度,結(jié)果RSD為0.46%，表明供試品在4 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：分別取6份口服液，同法制備供試品溶液，在340 nm處測定吸光度，計(jì)算樣品中香豆素的含量。結(jié)果RSD為1.03%，表明方法重復(fù)性好。

回收率試驗(yàn)：采用加樣回收法，先精密吸取已知含量的樣品口服液1 mL共6份，分別加入0.493、0.507、0.613、0.622、0.738、0.745 mg的濱蒿內(nèi)酯對照品，同法制成供試品溶液，測定它們的吸光度，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果香豆素平均回收率為98.64%，RSD為1.07%，表明方法回收率良好。回收率見表1。

表1 加樣回收率結(jié)果Tab 1 sample recovery results

樣品含量測定：取三份相同制備工藝下制備的口服液同法制成供試品溶液，分別在340 nm處測定其吸光度，計(jì)算香豆素含量。結(jié)果分別為0.715、0.717、0.723 mg/mL。

2.1.4 單因素水平篩選 上述所示制備工藝中沒有明確蒸餾水用量(料液比)、煎煮時(shí)間以及乙醇濃度(醇沉體積分?jǐn)?shù))[11-12]。本實(shí)驗(yàn)以這三個(gè)因素為考察對象，其中料液比水平見表2，煎煮時(shí)間水平見表3，醇沉體積分?jǐn)?shù)水平見表4。

表2 料液比Tab 2 feed ratio

表3 煎煮時(shí)間Tab 3 boiling time

表4 乙醇濃度Tab 4 Ethanol concentration

進(jìn)行單因素水平篩選時(shí)，控制其余兩個(gè)因素不變，其中進(jìn)行料液比水平篩選時(shí)煎煮時(shí)間為1.5 h，乙醇濃度為50%；進(jìn)行煎煮時(shí)間水平篩選時(shí)，料液比為1∶16，乙醇濃度為50%；進(jìn)行醇沉體積分?jǐn)?shù)水平篩選時(shí)，料液比為1∶16，煎煮時(shí)間為1.5 h。其余條件均按照制備工藝制成相應(yīng)的口服液。每個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次，按照上述含量測定方法測定各自香豆素含量，以三次實(shí)驗(yàn)測得的含量的平均值作為結(jié)果。料液比水平濃度曲線見圖1，煎煮時(shí)間水平濃度曲線見圖2，醇沉體積分?jǐn)?shù)水平見圖3。

圖1 料液比水平含量曲線Fig 1 liquid ratio of the level of content curve

圖2 煎煮水平含量曲線Fig 2 boiling horizontal curve

圖3 乙醇濃度水平含量曲線Fig 3 ethanol concentration level curve

本品為水溶性，主要成分為蒿屬香豆素屬于苷類，查中國藥典2015版第四部，50%～70%為乙醇浸出苷類的范圍。故選擇正交醇沉范圍為50%～70%。

2.1.5 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選 經(jīng)過單因素實(shí)驗(yàn)確定最佳料液比為1∶18，最佳煎煮時(shí)間為1.5 h，最佳醇沉分?jǐn)?shù)為60%。為了更好地優(yōu)化制備工藝，需對此三種因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)考察[13-15]。正交實(shí)驗(yàn)因素水平見表5，正交實(shí)驗(yàn)表見表6，依據(jù)正交實(shí)驗(yàn)表按照上述基本制備工藝熬制口服液樣品，每個(gè)水平熬制三份，并依法進(jìn)行香豆素含量測定，以三份測定平均值作為結(jié)果。結(jié)果見表7。

表5 正交實(shí)驗(yàn)因素水平Tab 5 Orthogonal experimental factors

表6 正交實(shí)驗(yàn)表格Tab 6 Orthogonal experiment table

表7 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 7 Orthogonal experimental results

經(jīng)篩選，得出水平7，即料液比1∶20，醇沉體積分?jǐn)?shù)50%，煎煮2 h為最佳制備工藝。

2.1.6 最佳制備工藝 取上述七味中藥在1000 mL大燒杯中加至560 mL蒸餾水浸泡30 min，煎煮2次，每次2 h。待藥液冷卻后，用濾布濾過，合并兩次濾液。棄去殘?jiān)瑢V液進(jìn)行濃縮，使藥液濃縮至相對密度1.02～1.05 g/mL即可。待濃縮液冷卻后向其中加入濃度為50%乙醇進(jìn)行醇沉，攪拌均勻后放置5 ℃冰箱靜置24 h。取出上清液過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中回收濾液中的乙醇。向回收乙醇后的藥液中加入蒸餾水使藥液達(dá)到28 mL。向藥液中加入0.1 g的苯甲酸鈉和0.1 g苯甲酸，攪拌均勻，用0.2%NaOH調(diào)pH值使藥液pH值在5～7之間。最后將所制的28 mL的藥液進(jìn)行分裝，滅菌，即可。

2.2 口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

2.2.1 茵陳的定性鑒別 取口服液10 mL，用乙酸乙酯提取2次，每次15 mL，合并醋酸乙酯提取液，將提取液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取茵陳對照藥材1 g，加甲醇20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為對照藥材溶液。取按照處方工藝制成的不含茵陳的樣品，同法制成陰性對照液。按照TLC法(《中國藥典》2015版四部通則0502)試驗(yàn)分別吸取上述溶液5～10 μL，分別點(diǎn)同一硅膠G薄層板上，以乙酸丁酯·甲酸-水(7∶2.5∶2.5)為展開劑，展開，取出，晾干。置紫外燈(365 nm)下檢視[16-17]。結(jié)果見圖4。供試品與對照藥材在相同位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對照品無干擾。

圖4 茵陳定性鑒別圖Fig 4 Yin qualitative identification chart

2.2.2 黨參的定性鑒別 取口服液10 mL，加水飽和的正丁醇提取2次，每次10 mL，合并兩次正丁醇液，將其蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為供試品溶液。另取黨參對照藥材1 g，先加少許水使?jié)駶櫍偌诱〈?0 mL，超聲處理15 min，進(jìn)行濾過，將濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為對照藥材溶液。再按處方比例，取按照相同制備工藝制成的缺黨參的樣品，同法制成陰性對照液。按照(20l5年版《中華人民共和國藥典》四部通則0502)試驗(yàn)，吸取上述溶液各5～10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，隨后噴上10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃條件下加熱，直至斑點(diǎn)顯色清晰[18]。結(jié)果見圖5。供試品與對照藥材在相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。

圖5 黨參定性鑒別圖

2.2.3 淫羊藿的定性鑒別 取口服液10 mL，加甲醇20 mL，搖勻后離心，取出上層清液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為供試品溶液。取同工藝制備的缺淫羊藿的樣品口服液，同法制成陰性對照溶液。另取適量淫羊藿苷對照品，加甲醇制成0.5 mg/mL的溶液，作為對照品溶液。吸取上述溶液各5～10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶1∶1∶1)為展開劑，展開后取出、晾干，置于紫外光燈(365 nm)下檢視[19]。結(jié)果見圖6。供試品色譜與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。

圖6 淫羊藿定性鑒別圖Fig 6 Epimedium qualitative identification map

2.2.4 高效液相色譜法測香豆素含量 色譜條件：色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水(34∶66)；檢測波長：340 nm；流速：1 mL/min；柱溫：25 ℃。

對照品溶液的制備：精密稱取濱蒿內(nèi)酯6.8 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇60 mL超聲溶解30 min，加甲醇至刻度線，搖勻即得對照品溶液。

供試品溶液的制備：精密吸取口服液1 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇60 mL超聲溶解30 min，隨后加甲醇稀釋至刻度線，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)：精密吸取供試品溶液與對照品溶液各10 μL，按色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，濱蒿內(nèi)酯主峰保留時(shí)間在8.4 min，供試品主峰保留時(shí)間與其一致，并且與其他組分分離良好。口服液高效液相色譜圖見圖7，濱蒿內(nèi)酯高效液相色譜圖見圖8。

線性關(guān)系考察：精密吸取68 μg/mL濱蒿內(nèi)酯對照品溶液1、5、10、15、20 μL，按上述色譜條件測定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，絕進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：Y=6×106X+18263，r=1。結(jié)果表明，濱蒿內(nèi)酯在6.8～136 μg范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn)：精密吸取68 μg/mL濱蒿內(nèi)酯對照品溶液10 μL，按照色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定其峰面積，結(jié)果RSD為0.58%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于配制后0、2、、6、24 h進(jìn)樣10 μL，測定峰面積，結(jié)果其RSD為0.63%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一口服液按上述供試品制備方法制得6份供試品溶液，各進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，并計(jì)算香豆素含量，結(jié)果RSD為1.82%，表明方法重復(fù)性良好。

回收率試驗(yàn)：采用加樣回收法，精密吸取已知含量的口服液1 mL，共6份，分別精密加入濱蒿內(nèi)酯對照品0.345、0.351、0.432、0.445、0.518、0.528 mg。按供試品制備方法制成加樣回收供試液，分別進(jìn)行含量測定，計(jì)算回收率[20]。結(jié)果平均回收率為98.12%，RSD為1.19%。表明方法回收率良好。結(jié)果見表8。

圖7 口服液高效液相色譜圖Fig 7 Oral liquid high performance liquid chromatography

圖8 濱蒿內(nèi)酯高效液相色譜圖Fig 8 scopolactone high performance liquid chromatography

編號取樣量/mL樣品香豆素含有量/mg濱蒿內(nèi)酯加入量/mg測得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%110.4360.3450.77397.68210.4360.3510.77696.87310.4360.4320.86799.77410.4360.4450.86897.08510.4360.5180.94498.07610.4360.5280.96099.2498.121.19

樣品測定：取三份口服液按供試品制備方法制成供試品溶液，進(jìn)樣10 μL測定峰面積，每份樣品測定2次，以2次測定結(jié)果的平均值作為測定值，計(jì)算香豆素含量。結(jié)果分別為0.435、0.439、0.434 mg/mL。

3 討 論

3.1 制備工藝優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)在進(jìn)行口服液制備工藝優(yōu)化試驗(yàn)前，參考了常明向等[15]瘟必清口服液制備工藝研究(君藥茵陳)、黃雄等[16]梔子-茵陳藥對提取工藝研究和肖瓊等[13]中藥醇沉工藝的關(guān)鍵影響因素初步確定了本口服液提取工藝的影響因素：浸泡時(shí)間、藥液相對密度、煎煮時(shí)間、乙醇濃度、料液比，中并通過以上因素進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，料液比、煎煮時(shí)間、乙醇濃度三個(gè)因素對本口服液制備工藝的影響較大。濃縮藥液相對密度在1.02～1.05 g/mL，浸泡時(shí)間在30 min適宜。如果藥液太濃，會導(dǎo)致進(jìn)行醇沉?xí)r藥液凝固較多，最后影響口服液質(zhì)量。先對料液比、煎煮時(shí)間、乙醇濃度進(jìn)行單因素水平篩選，試驗(yàn)時(shí)先用大梯度進(jìn)行篩選，找出合適范圍后，在范圍內(nèi)逐步將梯度縮小，進(jìn)行制備工藝的優(yōu)化。單因素篩選完成后，再結(jié)合正交試驗(yàn)法，進(jìn)一步篩選出最佳工藝。綜合篩選提取工藝中的主要影響因素，使優(yōu)選的提取工藝科學(xué)合理，并能有效反映該藥對藥效物質(zhì)的影響和變化規(guī)律，并且通過多次平行試驗(yàn)可以減少誤差，更具科學(xué)性和參考價(jià)值。可以為今后口服液工藝優(yōu)化提供參考。

3.2 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究 口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的創(chuàng)建一般分為兩個(gè)部分。第一部分為定性鑒別，第二部分為定量檢測。國內(nèi)外至今有關(guān)口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)創(chuàng)建的研究一般都公認(rèn)這兩個(gè)部分可以把控口服液的質(zhì)量。在薄層色譜中，由于待檢樣品為口服液，故不能直接按照中國藥典上的鑒別方法進(jìn)行定性測定。應(yīng)同時(shí)結(jié)合文獻(xiàn)，用相應(yīng)的方法將口服液樣品制成供試品，再進(jìn)行定性鑒別。本試驗(yàn)參考李建民等[12]在創(chuàng)建清肝利黃口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，對茵陳進(jìn)行薄層鑒別；張玉杰等[10]在創(chuàng)建參芪苓口服液的薄層色譜鑒別中，對黨參進(jìn)行薄層鑒別；陳林等[11]抗氧化口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中對淫羊藿進(jìn)行薄層鑒別，作為定性部分。參考萬麗等[7]茵陳中總香豆素的含量測定中對茵陳進(jìn)行HPLC法測定含量，作為定量部分。因而選擇茵陳、黨參、淫羊藿作為定性對象。選擇香豆素含量作為定量對象。由此創(chuàng)建了本口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，展開劑種類及其比例應(yīng)盡量以藥典為主，這樣各試樣中的組分可以達(dá)到較好的分離。在用HPLC法測定含量過程中，對色譜條件進(jìn)行了探索，其中流動相在甲醇與水、乙腈與水中進(jìn)行探索，發(fā)現(xiàn)選擇流動相為乙腈：水(34∶66)，時(shí)，可以使本試驗(yàn)中口服液各組分達(dá)到良好的分離。通過對單因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，找出單因素最佳水平，并結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)分析法，篩選出最佳工藝為料液比1∶20，煎煮時(shí)間2 h，乙醇濃度50%。用TLC法定性鑒別口服液中茵陳、黨參、淫羊藿，均有較好的結(jié)果。高液相色譜法中,口服液中主峰與雜峰有較好的分離,濱蒿內(nèi)酯保留時(shí)間適宜。口服液與濱蒿內(nèi)酯均在8.4 min左右出峰，最后測得口服液中香豆素含量平均為0.436 mg/mL。