重組產氣莢膜梭菌ε毒素三點突變體的融合表達及其免疫活性分析

杜吉革，張秀坤，朱 真，薛 麒，李啟紅，印春生，彭小兵，王 磊，姚文生，康 凱，陳小云

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

產氣莢膜梭菌是一種重要的人畜共患病原，其主要致病因子是其分泌的外毒素，能引起人和動物發病[1]。其中，ETX是該菌所有外毒素中毒力最強的毒素，能夠引起動物的壞死性腸炎或者腸毒血癥，導致感染動物在很短的時間內死亡，從而使抗生素治療失去意義[2]。為此，ETX的疫苗免疫是防制其所致疾病的主要手段。然而，傳統ETX的類毒素疫苗仍存在一定的缺點和安全隱患[2]。因此，無毒的ETX，對于開發ETX基因工程亞單位疫苗，及以其作為抗原組分的多價亞單位疫苗的研究和應用顯得尤為重要。

ETX主要是由B型和D型產氣莢膜梭菌產生，屬于成孔毒素家族。已有的研究證實，組氨酸殘基是影響ETX蛋白活性的關鍵性氨基酸，而第106位的組氨酸突變為脯氨酸的重組ETX基本是無毒的，然而該重組突變體的可溶性表達比例較低(小于5%)，不利于后續的大量生產和純化[2]。此外，姚文武[3]研究發現，第196位氨基酸突變后能夠明顯降低ETX毒力。在亞單位疫苗的研制中，增加Th細胞表位和佐劑能夠提高疫苗的免疫原性。已有的研究表明，口蹄疫病毒VP4蛋白的第20-35位氨基酸是一種良好的Th細胞表位[4]。作為一種應用較為廣泛的免疫佐劑，細菌的鞭毛蛋白(flagellin)主要是通過其高度保守的N端和C端來激動TLR-5受體，從而誘發機體產生更強的體液免疫與細胞免疫應答[5]。本研究利用基因合成技術，在對ETX編碼基因進行密碼子優化的同時，引入了3個氨基酸位點突變：Y30A、Y196A以及H106Y，從而降低了因單個氨基酸突變在未來基因工程疫苗大規模生產中可能造成的生物安全隱患。同時，引入VP4蛋白的Th細胞表位和鞭毛蛋白N末端第84-101位氨基酸(FN)的編碼序列，通過原核系統表達并純化重組蛋白，并對其毒力和免疫原性進行了研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 D型產氣莢膜梭菌C60-2株、D型產氣莢膜梭菌C60-2株天然毒素、兔源D型產氣莢膜梭菌抗血清以及pET30a-(+)表達載體均為本實驗室保存；1.5～2.0 kg普通級健康日本大耳白兔和16～18 g ICR小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；pEASY-Blunt Cloning Vector、感受態細胞Top10和BL21(DE3)購自北京全式金生物技術有限公司；Montanide ISA 201佐劑購自法國賽彼科(seppic)公司；Ni-IDA親和層析介質試劑盒、蛋白Marker、Western blot Marker、蛋白溶解液(50 mmol/L Tris-HCl, 10% Glycerol, 150 mmol/L NaCl, pH8.0)，均購自南京金斯瑞生物科技有限公司; 高保真PCR酶(KFX-401S)購自東洋坊公司；premix Taq version 2.0、DNA Marker購自Takara公司。T4 DNA連接酶、DNA凝膠回收試劑盒購自Promaga公司；限制性內切酶NdeⅠ和HindⅢ購自NEB公司；抗His標簽單抗、Bradford蛋白濃度測定試劑盒，購自碧云天生物技術有限公司；明膠緩沖溶液，LB培養基購自北京中海生物科技有限公司。

1.2 基因合成及密碼子優化 以D型產氣莢膜梭菌C60-3株ETX編碼基因為模版，按大腸桿菌偏愛的密碼子進行了優化設計，并引入3個氨基酸點突變：第30和196位酪氨酸突變為丙氨酸，第106位組氨酸突變為脯氨酸。此外，在突變基因5'端添加VP4蛋白的Th細胞表位和鞭毛蛋白N末端第84-101位氨基酸的編碼序列，在突變基因3'端添加6*His標簽蛋白編碼序列。由中美泰和公司人工合成基因片段GTFNETXm3。

1.3 ETX突變體原核表達載體的構建 以GTFNETXm3基因為模板，采用引物對1F/1R進行PCR擴增。其中上游引物1F序列為：5'-CGCCATATGAATAAAGTAAAATGT -3'，其5'端引入限制性內切酶NdeⅠ位點(下劃線部分)及保護性堿基；下游引物1R序列為：5'-CCGAAGCTTTTAGTGGTGATG，其5'端引入限制性內切酶HindⅢ位點(下劃線部分)及保護性堿基。PCR體系為50 μL，PCR反應條件為：94 ℃預變性4 min；98 ℃變性10 s，56 ℃退火30 s，68 ℃延伸90 s，共33個循環；最后68 ℃延伸7 min。擴增得到的目的DNA條帶，經回收后，采用NdeⅠ/HindⅢ雙酶切消化，與經過相同酶切消化的pET30a(+)載體連接。將連接好的質粒轉化Top10感受態細胞，挑取單克隆至含有卡那霉素的LB液體培養基中，37 ℃振蕩培養過夜，提取質粒進行PCR和雙酶切鑒定，鑒定結果為陽性的質粒送中美泰和公司測序，將測序正確的質粒命名為pET30a- GTFNETXm3。

1.4 重組蛋白的表達與鑒定 將質粒pET30a-GTFNETXm3轉化BL21(DE3)感受態細胞，分別在15 ℃和37 ℃條件下用IPTG誘導表達，收集菌體，超聲破碎后分別收集上清和沉淀，采用SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達情況及其可溶性，將表達的目的蛋白稱為rTFNETXm3。采用Western blot方法，以抗His標簽蛋白抗體為一抗，對重組蛋白做進一步的鑒定。

1.5 重組蛋白的純化與鑒定 按照Ni-IDA親和層析介質試劑盒的使用說明書對以包涵體形式表達的目的蛋白進行純化，用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，-80 ℃保存備用。采用Western blot方法檢測純化蛋白與D型產氣莢膜梭菌抗血清的反應性[2]。

1.6 重組蛋白的毒力測定[2]采用MDCK細胞檢測rTFNETXm3的細胞毒性；采用ICR小鼠檢測rTFNETXm3的小鼠毒性。

1.7 免疫原性分析[2]以純化的rTFNETXm3免疫日本大耳白兔，采用血清中和的方法測定兔血清的毒素中和效價；二免后21 d，用1個MLD的D型產氣莢膜梭菌天然毒素進行攻毒，判定試驗疫苗的免疫保護效力。

2 結 果

2.1 ETX突變體原核表達載體的構建 采用引物1F/1R進行PCR擴增，擴增片段經酶切后克隆至pET-30a(+)載體上。獲得的重組質粒經雙酶切后電泳觀察，結果如圖1所示。酶切后出現大小約5 kb的載體DNA片段，以及大小約1290 bp的目的基因片段，與預期相符。測序結果表明，插入的外源基因序列是正確的。將此重組質粒命名為pET30a-GTFNETXm3。

2.2 ETX突變體的原核表達鑒定 將重組表達質粒pET30a-GTFNETXm3轉化至BL21(DE3)感受態細胞并誘導表達。SDS-PAGE和Western blot檢測結果顯示，表達的目的蛋白分子量約為51 kDa，大小與預期相符。BL21(DE3)菌體在15 ℃誘導表達16 h后，rTFNETXm3具有較高比例的可溶性表達，而在37 ℃誘導表達4 h后，rTFNETXm3主要以包涵體的形式表達(圖2a)。圖2b為重組蛋白的Western blot鑒定結果，如圖所示，表達的目的蛋白能與抗His標簽抗體發生反應，證明目的蛋白含有His標簽，與預期相符。綜合考慮重組蛋白的表達量及誘導時間等條件，確定目的蛋白最適誘導表達條件為37 ℃，誘導表達4 h，收獲裂解后的沉淀蛋白，用于后續的純化。

1：DL5000 DNA相對分子質量標準; 2：重組質粒pET30a-GTFNETXm3的NdeⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定1：DL5000 DNA marker; 2： pET30a-GTFNETXm3 digested with NdeⅠand HindⅢ

a：重組蛋白表達的SDS-PAGE鑒定；b：重組蛋白與抗His單抗的Western blot M1：蛋白Marker；M2：Western blot Marker；PC1：BSA (1 μg)；PC2：BSA (2 μg)；NC.未誘導細胞裂解物；1：15 ℃ 16 h誘導的細胞裂解物；2：37 ℃ 4 h誘導的細胞裂解物；NC1：未誘導細胞裂解上清；NC2：未誘導細胞裂解沉淀；3：15 ℃ 16 h誘導的細胞裂解上清；4：15 ℃ 16 h誘導的細胞裂解沉淀；5：37 ℃ 4 h誘導的細胞裂解上清；6：37 ℃ 4 h誘導的細胞裂解沉淀a：The identification of recombinant protein expression by SDS-PAGE; b：The identification of recombinant protein with anti-His monoclonal antibody by Western blot M1：protein marker; M2：Western blot marker；PC1：BSA (1 μg) ; PC2：BSA (2 μg); NC：The cell lysates without induction; 1：The cell lysates induced with IPTG for 16 h at 15 ℃; 2：The cell lysates induced with IPTG for 4 h at 37 ℃;NC1：The supernatant of cell lysates without induction; NC2：The precipitation of cell lysates without induction; 3.The supernatant of cell lysates induced with IPTG for 16 h at 15 ℃; 4：The precipitation of cell lysates induced with IPTG for 16 h at 15 ℃;5：The supernatant of cell lysates induced with IPTG for 4 h at 37 ℃; 6：The precipitation of cell lysates induced with IPTG for 4 h at 37 ℃

2.3 ETX突變體的純化與鑒定 如圖3所示，按照Ni-IDA親和層析介質試劑盒說明書對以包涵體形式表達的rTFNETXm3進行純化，收集純度較高的Lane 7～12洗脫液進行透析和復性，最終獲得的蛋白濃度為1.03 mg/mL。將純化后的rTFNETXm3經SDS-PAGE電泳后轉印到PVDF膜上進行Western blot檢測。結果顯示，rTFNETXm3能夠與D型產氣莢膜梭菌抗血清反應(圖4)。

M1:蛋白Marker; 1:包涵體溶解離心后上清；2:清與Ni-IDA 孵育后流出液；3-4: 50 mmol/L Imidazole的洗脫液；5: 100 mmol/L Imidazole的洗脫液；6-11:500 mmol/L Imidazole的洗脫液M1:protein Marker; 1:The supernatant of dissolved inclusion bodies;2:The flow-through from Ni-IDA resin after incubated with supernatant;3-4:The elution from Ni-IDA resin washed with elution buffer(contain 50 mmol/L Imidazole); 5:The elution from Ni-IDA resin washed with elution buffer (contain 100 mmol/L Imidazole);6-11:The elution from Ni-IDA resin washed with elution buffer (contain 500 mmol/L Imidazole)

M：蛋白Marker；1.未誘導的細胞裂解物；2：純化后的rTFNETXm3M:Protein Marker;1:The cell lysates without induction;2:rTFNETXm3 after purification

2.4 rTFNETXm3的毒力測定

2.4.1 對MDCK細胞的毒力測定 MDCK細胞加入各組分后繼續培養24 h，顯微鏡下觀察。1000倍稀釋的天然D型產氣莢膜梭菌毒素接種細胞組出現了明顯的細胞病變，多數細胞崩解(圖5a)；接種濃度為100 μg/mL、10 μg/mL rTFNETXm3蛋白的實驗組(圖5b)、接種肉肝胃酶消化湯和洗脫液的陰性對照組及空白對照組細胞均生長良好，未出現細胞病變(圖5c)。

2.4.2 rTFNETXm3對小鼠的毒力測定 經過胰酶活化的rTFNETXm3，分別10 μg/只及100 μg/只的劑量尾靜脈注射小鼠，結果rTFNETXm3注射組及肉肝胃酶消化湯注射組小鼠，在注射后24 h均存活，未見任何異常。注射1個MLD天然毒素的小鼠，在注射后24 h內全部死亡。以上結果說明rTFNETXm3已成功減毒，即使經過胰酶活化后，在本實驗注射劑量范圍內，對小鼠依然是無毒的。

2.5 ETX突變體的免疫原性分析

2.5.1 血清毒素中和抗體效價的測定 如表1所示，經血清中和法測定，以rTFNETXm3制備疫苗免疫家兔后，每毫升的一免抗血清可中和80～120個MLD的D型產氣莢膜梭菌毒素；每毫升的二免抗血清可中和750～1100個MLD的D型產氣莢膜梭菌毒素，而佐劑對照組的兔血清對D型產氣莢膜梭菌毒素無中和作用。以上結果表明，rTFNETXm3的免疫效力遠高于現行《中華人民共和國獸藥典》的規定標準，是優良的制苗用候選抗原。

2.5.2 攻毒保護性試驗 在二免后21 d，對所有rTFNETXm3免疫組和佐劑免疫對照組的家兔，經耳緣靜脈注射1個MLD的D型產氣莢膜梭菌天然毒素進行攻毒，結果顯示：佐劑免疫對照組家兔在攻毒后5 d內全部死亡，rTFNETXm3免疫組家兔全部健活，未見任何不良反應，保護率達100%。

3 討 論

ETX屬于成孔毒素家族，在結構上主要分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三個區域，分別在毒素與細胞受體結合過程、與細胞受體結合穩定性的維持以及細胞膜穿孔的形成過程中發揮著重要作用[6]。由于毒素中有2條35個氨基酸的肽鏈同時跨過Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ三個區域[7]，導致僅使用毒素的一個域作為疫苗候選抗原的策略(如α、β毒素的C末端[8-9])很難應用于該毒素的防控。在無毒重組ETX亞單位疫苗的研究中，經典的無細胞毒性的突變體為第106位組氨酸突變為脯氨酸的ETX重組蛋白，其安全性和免疫原性已經得到大量驗證[10-11]。雖然該突變體蛋白可溶性較低，但由于考慮到以包涵體形式表達的蛋白可能缺乏正確的空間構象，導致研究者通常選擇表達水平較低的可溶蛋白[6, 12]，而以包涵體形式表達的毒素突變體的活性以及免疫原性尚未見報道。

a: 加入1000倍稀釋的天然毒素培養液后培養24h的細胞；b1-b2:分別加入濃度100 μg/mL以及10 μg/mL的rTFNETXm3培養液后 培養24 h的細胞；c1:蛋白洗脫液對照；c2:用于培養D型產期莢膜梭菌的肉肝胃酶消化湯對照；c3: 細胞培養基對照a: MDCK cell cultured with the toxin-containing medium of Clostridium perfringens type D with dilution 1000 for 24 h；b1-b2:MDCK cell cultured with rTFNETXm3-containing medium with concentrate of 100 μg/mL and 10 μg/mL, respectively, for 24 h;c1:MDCK cell cultured with elution buffer control; c2: MDCK cell cultured with anaerobic beef, liver and stomach digestive enzyme soup used by Clostridium perfringens type D; c3: Cell culture control

rTFNETXm3是在37 ℃誘導4 h獲得的以包涵體形式表達的重組蛋白，對MDCK細胞以及小鼠在檢測范圍內均未表現出毒性，與已有的文獻報道的突變體毒力測定結果相符[3]。而rTFNETXm3一免兔血清每毫升可中和80 MLD以上，二免兔血清每毫升可中和750 MLD以上，效果明顯優于目前的商品化疫苗標準(30 MLD)[13]，說明以包涵體形式表達的rTFNETXm3經純化復性后具有良好的免疫原性。與可溶性表達的蛋白純化過程相比，以包涵體形式表達的重組蛋白在純化中可最大程度的降低蛋白中內毒素的含量，更適用于大規模獸用疫苗的制備。