發酵兔肉醬揮發性風味物質的研究

王東，丁德龍，李華

(1.常州旅游商貿高等職業技術學校，江蘇 常州 213032；2.青島酒店管理職業技術學院，山東 青島 266100；3.揚州大學 旅游烹飪學院，江蘇 揚州 225001)

在感官方面，肉制品的風味是決定其整體可接受性的一個重要因素。肉制品獨特的風味，是由滋味活性成分和香味活性成分共同形成的。滋味成分一般為非揮發性物質，但香味成分幾乎都是揮發性的。人們能否接受某種食品取決于其風味的優劣，而評價風味首先是其香味。因此，揮發性風味組分對食品總體風味的形成起著非常重要的作用。不同風味成分的閾值對食品的累積感官屬性都有重要影響[1]。因此，分析檢測發酵兔肉醬中的揮發性風味物質，可以得到有關發酵兔肉醬微生物學、酶學以及化學等方面的重要信息[2]。

1 材料與方法

1.1 原材料及菌種

菌種：植物乳桿菌L21、葡萄球菌C5；

原料：無土腥味野兔肉，由鹽城市食為天野兔專業合作社提供；輔料：葡萄糖、蔗糖(A.R.級)；食鹽、脫皮芝麻、香辣醬、豆豉，均為市售食品級。

1.2 主要儀器與設備

手動SPME進樣器、復合式75 μm CAR/PDMS萃取頭 美國Supelco公司；TR-5MS石英毛細管柱、Trace DSQ II 氣相色譜-質譜聯用儀、Trace GC Ultra氣相色譜儀 美國Thermo公司；HSX-250型恒溫恒濕培養箱 上海福瑪實驗設備有限公司；SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；YX280B型手提式壓力蒸汽滅菌器 上海三申醫療器械有限公司；HH-8數顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備

基本配方：兔肉、蔗糖0.5%、葡萄糖0.5%、食鹽2.5%、水12%、豆豉4%、脫皮芝麻2%、四川香辣醬4%。

制作方法：兔肉解凍→預處理→絞碎→拌料(加蔗糖、葡萄糖、食鹽和水)→接種→發酵→拌料(加豆豉、芝麻和香辣醬)→真空包裝(高溫蒸煮袋)→滅菌→成品。

發酵劑菌液制備：對篩選菌株進行糖類發酵試驗，采用生化反應管檢驗，通過觀察菌株對各種糖的利用情況確定其屬種。將待鑒定菌株接種于生物反應管后于30 ℃培養24 h，觀察培養基的顏色是否變化，若變為黃色，則為陽性，表明可發酵該糖并產酸。

操作要點：①兔肉預處理：將冷凍兔肉置于室溫下解凍約4 h，清洗，去筋膜，絞碎。②接種發酵：肉糜中加入蔗糖、葡萄糖、食鹽和水，混勻，添加發酵劑，再混勻攪拌。③發酵：密封，避光，于適宜條件下發酵。④拌料：發酵完成后，添加豆豉、芝麻和香辣醬等調味制醬。⑤包裝滅菌：將發酵成熟的兔肉放入耐高溫的包裝袋中，真空包裝，封口，高壓鍋121 ℃滅菌20 min，同時起到熟化肉醬的作用。

1.3.2 揮發性風味物質的提取

參照Pignoli G等[3]的方法，采用靜態頂空固相微萃取(SPME)法提取風味物質中的揮發性風味成分。

稱取20.0 g樣品，室溫下迅速均勻切碎后，置于萃取瓶內，錫紙封口，封口膜密封。復合式75 μm CAR/PDMS萃取頭使用前先在氣相色譜進樣口(250 ℃)老化20 min，插入密封的萃取瓶，萃取纖維頭探伸至樣品上部的頂空中，在60 ℃水浴條件下吸附40 min，以備進樣，進行GC-MS分析。

1.3.3 揮發性物質的鑒定

將萃取頭插入進樣口(250 ℃)解吸2 min，抽回纖維頭后拔出萃取頭，啟動儀器進行分析檢測。

氣相色譜條件：色譜柱為TR-5MS石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣為N2，流速為1 mL/min，進樣口溫度保持在250 ℃，以不分流方式進樣。程序升溫條件：起始溫度40 ℃，保持1 min，然后以5 ℃/min的速度升溫至130 ℃，8 ℃/min的速度升溫至200 ℃，12 ℃/min的速度升溫至250 ℃，保持7 min。質譜條件：離子源為EI源，能量為70 eV，溫度為200 ℃；接口溫度為250 ℃；檢測器電壓為350 V；發射電流為150 μA；掃描范圍為33～500 amu。

1.3.4 圖譜分析

定性分析：經GC-MS分析，根據標準圖譜庫NIST Library中的數據，對各色譜峰的質譜圖進行人工分析和檢索，對物質進行定性，確定揮發性成分。

定量分析：各揮發性風味物質的相對含量用其在圖譜中對應的峰面積和峰面積百分比例表示。

2 結果與分析

2.1 兔肉醬發酵前后揮發性風味物質的比較

發酵前后樣品中揮發性風味化合物總離子流色譜圖見圖1和圖2。

圖1 兔肉醬發酵前揮發性風味物質氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of flavor components in unfermented rabbit meat paste

圖2 兔肉醬發酵后揮發性風味物質氣相色譜圖Fig.2 Gas chromatogram of flavor components in fermented rabbit meat paste

對未發酵兔肉醬和發酵兔肉醬的風味物質進行分析比較，相對峰面積≥0.2%的揮發性風味物質見表1。

表1 發酵前后兔肉醬的風味成分分析Table 1 Flavor components analysis of rabbit meat paste before and after fermentation

續 表

本試驗對接種復合發酵劑發酵的兔肉醬和未發酵的對照樣品進行揮發性風味成分的檢測和分析。由表1可知，發酵組樣品中共檢測出相對峰面積≥0.2%的揮發性風味化合物48種，未發酵組樣品中共檢測出42種，這些揮發性成分主要是醇類、醛類、酸類、烴類、酮類、酯類、醚類和雜環類。

表2 樣品中各類化合物相對百分含量Table 2 The relative percentage of compositions in samples

由表2可知，未發酵組中包括醇類7種，相對百分含量23.84%；醛類13種，相對百分含量25.43%；酸類3種，相對百分含量1.61%；烴類6種，相對百分含量3.44%；酮類4種，相對百分含量1.31%；酯類4種，相對百分含量1.90%；醚類3種，相對百分含量1.09%；雜環類化合物2種，相對百分含量7.42%。

發酵組樣品中包括醇類7種，相對百分含量19.94%；醛類15種，相對百分含量24.68%；酸類4種，相對百分含量2.23%；烴類9種，相對百分含量5.87%；酮類5種，相對百分含量1.24%；酯類4種，相對百分含量2.48%；醚類2種，相對百分含量2.54%；雜環類化合物2種，相對百分含量9.75%。

可以看出，在未發酵和發酵組中都是醛類化合物的種類最多，其次是醇類和烴類。由于微生物發酵劑的作用，發酵組樣品中相對含量在0.2%以上的揮發性風味物質種類發生了明顯的變化，除了酯類、醚類和雜環類化合物之外，其他化合物的種類都有不同程度的增加。有研究表明，食品中蛋白質和脂質等物質都可以通過各分子間相互作用吸附風味化合物，從而影響風味化合物的釋放，蛋白質和脂肪的含量也會影響揮發性化合物的風味強度[4,5]，溫度也會影響蛋白質與風味化合物的吸附常數和結合位點[6]。

2.2 兔肉醬發酵前后主體風味物質成分分析

由表2可知，未發酵樣品中醛類和醇類化合物是主要的風味物質，其次是雜環類化合物、烴類、酯類等。經過發酵，揮發性風味成分發生了變化，醛類仍是占比最大的一類化合物，其次是醇類、雜環類化合物和烴類，占有較大比重。在發酵過程中，部分醇類和醛類會被氧化，使醇類和醛類化合物的占比減少，而烴類和雜環類化合物的相對百分含量增加，變化較明顯。從總體上看，發酵制品的風味得到了改善，主要的揮發性風味成分的百分含量也發生了改變。醛類化合物為發酵制品風味的主要貢獻者，相對百分含量達到了24.68%，其次是醇類化合物(19.94%)、雜環類化合物(9.75%)和烴類化合物(5.87%)。

2.2.1 醇類化合物分析

在未發酵組和發酵組中最主要的醇類化合物都是戊醇，分別占比達到21.94%和17.66%，包括2-甲基環戊醇和3,4-二甲基-1-戊醇2種，共同檢測到的醇類物質還有2-甲基-5-甲基乙烯基-環己醇。在未發酵組中檢測到一定量的1-辛烯-3-醇、二氫香芹醇、反,反-2,5-十二碳二烯-1-醇，而發酵組中未檢測到，說明經過發酵和加溫過程后，可能化合物間發生了化學反應，導致發酵組中未檢測出。在發酵組中檢測到苯基乙醇、2-辛烯-1-醇、2-亞硝基-2-庚醇、2,4-癸二烯-1-醇，而未發酵組中卻沒有，表明這幾種化合物可能是在發酵過程中產生的。

2.2.2 醛類化合物分析

肉制品中的醛類化合物一般是原料中固有或酯類經氧化分解生成的，醛類是閾值相對較低的化合物，因此也是肉類風味物質的重要貢獻者。發酵組和未發酵組中共同檢測到的醛類物質包括壬醛、辛醛、癸醛、十六醛、2-辛烯醛、2-癸烯醛、2-壬烯醛、2-庚烯醛和苯甲醛這9種，發酵過程使得其中一些醛類物質減少，同時也出現了另外一些在未發酵組中檢測不到的醛類。壬醛會呈現特別的脂味，辛醛一般具有清香味，庚醛具有腌肉的香味，2-庚烯酸會呈現油脂香味。而苯甲醛已被鑒定為烤花生的主要羰基化合物，具有令人愉悅的杏仁香、堅果香和水果香[7]。苯甲醛是由不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸氧化降解生成的各種小分子化合物形成[8]。由表1可推知，壬醛、2-辛烯醛和庚醛對未發酵兔肉的風味貢獻較大，經過發酵處理以后，其相對百分含量大大減少，在發酵組中甚至未檢出庚醛。發酵組揮發性風味物質中的主要醛類物質有己醛糖、壬醛、十六醛、辛醛、2,4-庚二烯醛、2-十一碳烯醛、2-辛烯醛、2-癸烯醛、2,4-十碳二烯醛和苯甲醛。

2.2.3 酸類化合物分析

脂肪和磷脂的分解以及氨基酸的脫氨基作用可以產生酸類化合物，試驗中共檢測到酸類化合物5種，分別為環己基-1,4,5-三羥基-3-羰基-1-羧酸、十五烷酸、乙酸、壬酸、辛酸。只有乙酸在未發酵和發酵樣品中都有檢測到。乙酸帶有刺激性氣味，揮發性強，具有一定的酸味。未發酵樣品中檢測到3種酸類化合物，分別是環己基-1,4,5-三羥基-3-羰基-1-羧酸(0.70%)、十五烷酸(0.56%)、乙酸(0.35%)。發酵樣品酸類化合物中十五烷酸(0.73%)和乙酸(0.69%)也占比較大，在發酵樣品中還出現了壬酸和辛酸，占比分別達到0.48%和0.33%。

2.2.4 酮類化合物分析

酯類的分解或者醇類的氧化都可以生成酮類化合物，試驗中檢測到的酮類化合物共有8種，含量都不高。2-庚酮在2組樣品中都有檢測到，發酵后其占比有所下降。在未發酵組中占比最大的是環戊酮(0.39%)，發酵組中占比較大的是3-叔丁基-3-羥基苯甲酮(0.29%)和5-癸酮(0.33%)，此外，還檢測到2,4-十二碳二烯-1-酮和3-羥基-2-丁酮，分別占比0.22%和0.20%。3-羥基-2-丁酮具有奶制品香味和油脂味。

2.2.5 酯類化合物分析

試驗中共檢測到酯類化合物7種，在2組樣品中共同檢測到的是9,12-十八碳二烯酸甲酯。乙酸乙酯在未發酵組酯類化合物中占比最大，達到0.75%。而發酵組樣品中氨基甲酸甲酯和9,12-十八碳二烯酸甲酯的貢獻較大，占比分別為0.74%和0.68%。此外，在發酵樣品中還檢測到一定的癸酸乙酯和辛酸乙酯。

2.2.6 其他化合物分析

碳氫化合物主要來源于脂肪酸烷基自由基的均裂。烴類化合物的閾值較高，所以對制品風味的貢獻不顯著。試驗共檢測到12種烴類化合物，其中，十三烷、正十五烷和2-三氟乙酰氧基十二烷是在2組樣品中共同檢測到的。在發酵組樣品中檢測出五甲基苯、苯并環庚三烯、1-亞甲基-1-氫-茚、1-甲基萘等在未發酵組中沒有檢測到的化合物。在未發酵組中，1-環丙基戊烷所占比重最大，為1.24%；在發酵組中，1-甲基萘所占比重最大，為1.52%。

雜環化合物的閾值較低，是肉品中重要的風味化合物，氨基酸和還原糖之間的美拉德反應可產生雜環類化合物及含氮含硫物質[9]。呋喃和吡嗪是美拉德反應的特征性產物，具有肉品的烘烤風味。在2組樣品中都檢測到含量較高的2-戊基呋喃，在未發酵組和發酵組中分別占比6.14%和9.38%。在發酵組樣品中出現3-(1-環戊烯基)呋喃，占比為0.37%，這與研究發現的肉品風味中起作用的呋喃類物質基本一致。

3 小結

本試驗用GC-MS方法對未發酵和發酵的兔肉醬樣品中的揮發性風味物質進行檢測和分析，共檢測出相對峰面積≥0.2%的揮發性風味化合物68種。

發酵樣品中檢測出48種，包括醇類7種、醛類15種、酸類4種、烴類9種、酮類5種、酯類4種、醚類2種、雜環類化合物2種，其中醇類占19.94%，醛類占24.68%，酸類占2.23%，烴類占5.87%，酮類占1.24%，酯類占2.48%，醚類占2.54%，雜環類化合物占9.75%；未發酵樣品中檢測出42種，包括醇類7種、醛類13種、酸類3種、烴類6種、酮類4種、酯類4種、醚類3種、雜環類化合物2種，其中，醇類占23.84%，醛類占25.43%，酸類占1.61%，烴類占3.44%，酮類占1.31%，酯類占1.90%，醚類占1.09%，雜環類化合物占7.42%。

微生物發酵劑的作用使發酵樣品中相對含量在0.2%以上的揮發性風味物質種類或含量發生了顯著的變化，除了酯類、醚類和雜環類化合物之外，其他化合物的種類都有不同程度的增加，表明發酵劑對兔肉醬風味的改善有明顯效果。

在未發酵組和發酵組中最主要的醇類化合物都是戊醇，分別占比21.94%和17.66%，共同檢測到的醇類物質還有2-甲基-5-甲基乙烯基-環己醇；共有的醛類化合物有9種，但相對含量發生了顯著變化。發酵組中的主要醛類物質有己醛糖、壬醛、十六醛、辛醛、2,4-庚二烯醛、2-十一碳烯醛、2-辛烯醛、2-癸烯醛、2,4-十碳二烯醛和苯甲醛；酸類、酮類、酯類的種類和占比都比較少；烴類的種類較多，但對風味的影響不顯著；2組樣品中都檢測到含量較高的雜環類化合物2-戊基呋喃，在發酵組樣品中檢測到3-(1-環戊烯基)呋喃。