酶解蝦皮用于料酒生產的研究

劉姍，楊柳*，何述棟，孫漢巨，姚升飛，徐尚英

(1.合肥工業大學 食品科學與工程學院，合肥 230009；2.安徽海神黃酒集團有限公司，安徽 廬江 231561)

烹飪黃酒(即料酒)以粳米為主要原料，經過麥曲、酒曲中多種微生物的糖化、發酵釀制而成。料酒中所含的氨基酸態氮能使烹飪的菜肴口味更鮮美，適量的乙醇能使肉類中有腥膻味道的蛋白和胺類揮發掉且不破壞肉的蛋白和酯類，酯類物質能增加菜肴的香味[1]。料酒中氨基酸態氮含量與其鮮味之間相關[2]。近年來，為適應各種烹調要求，蔥姜料酒、葛根料酒和五香料酒等諸多類型的調味料酒被相繼開發出來[3-5]。隨著消費者認知的日益理性，安全、健康的釀造料酒新產品勢必受到消費者的青睞。

蝦皮主要是以毛蝦為主，經過蒸煮、晾曬、烘干等工序加工而成的一種食用干制品。蝦皮中蛋白含量可高達40%，還富含鈣、鉀、碘、鎂、磷等礦物質及有“超級維生素E”美譽的蝦青素[6-8]。蝦皮氨基酸中谷氨酸含量最高，賦予了蝦皮濃郁的鮮香味[9]。目前市場上的蝦味調味品主要是蝦醬、蝦粉等[10]，關于蝦皮料酒的研究很少。蝦皮溶解度低，不宜直接添加至料酒中。本研究通過對蝦皮進行酶解，將蝦皮酶解液作為輔料用于料酒發酵生產，開發出一款蝦皮料酒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蝦皮：家樂福超市；甲醛、NaOH、無水乙醇、亞鐵氰化鉀：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；水合茚三酮(99.9%)：美國Sigma-Aldrich公司；釀酒曲(紹興風味)和安琪釀酒高活性干酵母(黃酒專用)：安琪酵母股份有限公司；堿性蛋白酶(2×105U/g)、中性蛋白酶(5×104U/g)：北京奧博星生物技術有限公司；木瓜蛋白酶(1×105U/g)：南寧東恒華道生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；752N型分光光度計 上海第三分析儀器廠；S-4330D氨基酸分析儀 德國Sykam(賽卡姆)公司；SHP-250型生化培養箱 上海三發科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蝦皮酶解工藝優化

蝦皮→烘干→粉碎→酶解→滅酶→離心(5000 r/min,10 min)→蝦皮酶解液。

單因素試驗：分別考察蛋白酶種類(木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶)、酶添加量(0，200，400，800，1000 U/g，以每1 g蝦皮干重計)、酶解溫度(40，45，50，55，60 ℃)、pH(5.0，6.0，7.0，8.0，9.0)、酶解時間(1，1.5，2，2.5 h)和料液比[1∶5，1∶10，1∶15，1∶20 (g/mL)]對蝦皮酶解效果的影響，以其中一個因素為單因素變量，其他條件一定的前提下，進行單因素試驗。

正交試驗：在單因素試驗的基礎上，以酶添加量、酶解時間和料液比為研究對象，以氨基酸態氮含量為指標，用L9(34)正交試驗來研究不同條件下的蝦皮酶解效果。

1.3.2 料酒制備

取一定量的粳米，加入同等質量自來水(水質要求符合GB 5749-2006《生活飲用水衛生標準》)，25 ℃浸泡48 h，瀝去水，取60 g浸泡后粳米(干重約40.0 g)分裝于250 mL三角瓶中，加入40 mL自來水，包扎封口后，置于滅菌鍋中，在0.05 MPa下保溫15 min進行蒸飯。向冷卻至28 ℃左右的米飯中加入0.08 g釀酒曲、0.08 g釀酒高活性干酵母和40 mL無菌水混合并攪拌均勻。在28 ℃下保溫培養，每隔4 h攪拌1次，培養5天后在18 ℃下繼續培養14天，得到成熟料酒發酵醪，將醪液離心，上清液即為料酒原酒液。

1.3.3 蝦皮酶解液添加時間對料酒發酵的影響

在料酒發酵過程中，向米醪中添加蝦皮酶解液，添加量為2.0%，添加時間分別為0，24，48，72，96 h，待料酒發酵結束后，測定料酒原酒液中的總糖含量、酒精度、氨基酸態氮含量。

1.3.4 蝦皮酶解液添加量對料酒發酵的影響

將蝦皮酶解液添加到米醪中，添加量分別為0，1.0%，2.0%，4.0% (酶解前蝦皮干重占總物料干重的百分數)，待發酵結束后，測定料酒原酒液中的總糖含量、酒精度、氨基酸態氮含量。

1.3.5 添加蝦皮酶解液對料酒中游離氨基酸的影響

將蝦皮酶解液以2.0%的添加量添加到米醪中進行料酒發酵，待發酵結束后，利用S-4330D氨基酸分析儀測定料酒原酒液中游離氨基酸的種類和含量。

1.4 感官評價

請10名食品專業人員作評定員，彼此獨立對蝦皮料酒樣品進行感官評定，互不影響，以保證結果準確。對蝦皮料酒的感官評定，主要針對色澤、香氣、口味和風格4個方面。每個屬性的評定均采用5分制，每個屬性的質量等級如下：優(4～5)、良好(3～4)、中(2～3)、差(1～2)。通過統計計算，得出產品的總體感官質量等級。

1.5 分析方法

1.5.1 酒精度的測定

蒸餾法[11]。

1.5.2 總糖含量的測定

亞鐵氰化鉀滴定法。

1.5.3 氨基酸態氮含量的測定

酶解液或發酵醪經離心(5000 r/min，10 min)，上清液中氨基酸態氮含量參照GB/T 5009.235-2016《食品中氨基酸態氮的測定》[12]。

料酒中游離氨基酸的測定參照GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的測定》[13]。

1.6 數據處理

所有試驗重復3次，應用Excel軟件作圖，數據以平均值±標準偏差表示，采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析，組間比較采用單因素方差分析中的Duncan法檢驗。

2 結果與分析

2.1 蝦皮酶解條件的研究

2.1.1 單因素試驗

根據相關蝦皮酶解文獻的報道[14]，選取對蝦皮酶解影響顯著的幾個主要因素如蛋白酶種類、酶添加量、酶解時間、pH值、溫度和料液比等進行單因素試驗，以酶解液中氨基酸態氮含量為測定指標，結果見圖1。

圖1 蛋白酶種類、中性蛋白酶添加量、初始溶液pH、酶解時間、酶解溫度和料液比對蝦皮酶解的影響

注：圖1(a)中1為對照組；2為木瓜蛋白酶；3為中性蛋白酶；4為堿性蛋白酶。

由圖中1中(a)可知，中性蛋白酶對蝦皮的酶解效果最好。因為蝦皮獨特的細胞結構，用中性蛋白酶破壞其細胞壁結構從而使細胞內的呈味核苷酸和氨基酸等風味成分得到釋放。由圖1(b)可知，氨基酸態氮含量隨著中性蛋白酶添加量的增加而增大，當添加量大于800 U/g(蝦皮干重)時氨基酸態氮含量增加不明顯。由圖1(c)和圖1(e)可知，初始溶液pH和酶解溫度在中性蛋白酶最適酶解條件下效果最佳，分別為pH 7.0，50 ℃。由圖1(d)可知，酶解時間為2 h時氨基酸態氮含量達到最大值0.930 g/L。由圖1(f)可知，隨著料液比的增加，氨基酸態氮的含量呈先增加后降低的趨勢，當料液比為1∶10時氨基酸態氮的含量達到最大值0.932 g/L，因為隨著料液比的增加，對酶的稀釋度越來越大，酶的實際作用效果降低。

表1 蝦皮酶解顯著性分析結果Table 1 Significance analysis results of dried shrimp enzymolysis

注：顯著性差異用“*”表示；置信水平為0.95。

對影響蝦皮酶解的5個因素做顯著性分析，由表1可知，中性蛋白酶添加量、酶解時間、料液比對蝦皮酶解影響顯著，酶解溫度和pH影響不顯著。因為pH值和酶解溫度均在中性蛋白酶最適范圍內效果最佳，屬于酶的特征參數，較為確定。

2.1.2 正交試驗結果與分析

在單因素試驗結果的基礎上選取對蝦皮酶解影響顯著的3個因素：酶添加量(400，800，1000 U/g)、酶解時間(1.5，2，2.5 h)、料液比(1∶5，1∶10，1∶15)作為正交試驗的因素，每個因素分別取3個水平。試驗以氨基酸態氮含量為評價指標，試驗設計和結果見表2。

（1）政策文件方面：黨和國家領導人高度重視質量信用建設工作，多次在重要場合、重要會議上強調，要堅持以質量第一為價值導向、牢固樹立質量第一的強烈意識，并相繼出臺了多項政策性文件指導質量誠信體系建設，包括《征信業管理條例》《中共中央 國務院關于開展質量提升行動的指導意見》《質量發展綱要（2011-2020年）》《社會信用體系建設規劃綱要（2014-2020年）》以及《企業質量信用評價工作方案》等。

表2 正交試驗設計及結果Table 2 Design and results of orthogonal test

由表2可知，在影響中性蛋白酶酶解蝦皮的諸多因素中，各因素作用的主次順序為B>A>C，即料液比的影響最大，酶添加量次之，酶解時間的影響最小，誤差的影響則更小，可以忽略；最優酶解提取條件組合為A2B2C2。取最優條件做驗證試驗，氨基酸態氮含量為0.935 g/L，且所得酶解物鮮味濃郁。因此確定蝦皮的最佳酶解條件為中性蛋白酶添加量800 U/g(蝦皮干重)、料液比1∶10 (g/mL)、50 ℃、pH 7.0條件下酶解2 h。

2.2 蝦皮酶解液的添加時間對料酒發酵的影響

將蝦皮酶解液以2.0%添加量，添加到米醪中進行發酵，研究在不同發酵時間添加對料酒酒精度和氨基酸態氮含量的影響，結果見表3。

表3 蝦皮酶解液的添加時間對料酒發酵的影響Table 3 Effects of dried shrimp hydrolysate addition time on cooking wine fermentation

注：n=3, P<0.05。

由表3可知，在發酵72 h時添加蝦皮酶解液，料酒發酵效果最佳，料酒中酒精度、總糖和氨基酸態氮的含量符合QB/T 2745-2005《烹飪黃酒》質量標準，且其中氨基酸態氮已達到優級烹飪黃酒要求(不低于0.4 g/L)。在發酵0，24，48 h時向米醪中添加蝦皮酶解液，其中大量的營養物質被發酵醪中霉菌、酵母菌等微生物生長繁殖所消耗，致使發酵前期酒精度上升過快，抑制了具有糖化作用的霉菌的生長、產酶，從而不利于發酵后期酒精度的積累，也使得氨基酸態氮含量較低[15]；在發酵96 h時添加，發酵已接近尾聲，添加蝦皮酶解液，達不到共發酵的作用，造成料酒中殘余較多的氨基酸態氮和糖，同時酒精度也較低，不利于料酒后發酵的貯藏。因此，確定蝦皮酶解液的添加時間為72 h。

2.3 蝦皮酶解液的添加量對料酒發酵的影響

將蝦皮酶解液添加到米醪中，研究不同添加量對料酒發酵的影響，結果見表4。

表4 蝦皮酶解液的添加量對料酒發酵的影響Table 4 Effects of dried shrimp hydrolysate content on cooking wine fermentation

注：n=3, P<0.05。

由表4可知，蝦皮酶解液的添加量對料酒氨基酸態氮和總糖含量影響顯著，且酒精度和氨基酸態氮含量與酶解液的添加量成正相關。酶解液添加量為2.0%時，氨基酸態氮含量為(0.463±0.019) g/L，較對照增加了237.96%，因為蝦皮酶解液中含有大量的含氮類物質，致使料酒中氨基酸態氮含量較高，同時也為酵母生長提供了營養，以至于提高料酒的酒精度，降低醪液中的總糖含量。而且制備的料酒中氨基酸態氮的含量符合QB/T 2745-2005優級烹飪黃酒質量標準的規定。因此，選擇蝦皮酶解液的添加量為2.0%。

2.4 添加蝦皮酶解液對料酒中游離氨基酸的影響

氨基酸不僅是料酒中主要的營養成分，還是料酒的主要呈味物質，它的種類和含量與料酒的風味及感官品質有著密不可分的聯系。探究了添加蝦皮酶解液對料酒中游離氨基酸種類和含量的影響，結果見表5。

表5 添加蝦皮酶解液對料酒中氨基酸組成的影響Table 5 Effects of dried shrimp hydrolysate on amino acidcomposition in cooking wine g/L

注：ND表示未檢測到。

根據不同種氨基酸對風味的貢獻可將氨基酸分為4類[16]：甜味氨基酸(絲氨酸Ser、丙氨酸Ala、蘇氨酸Thr、甘氨酸Gly、半胱氨酸Cys、蛋氨酸Met)、鮮味氨基酸(天冬氨酸Asp、谷氨酸Glu)、苦味氨基酸(精氨酸Arg、組氨酸His、纈氨酸Val、苯丙氨酸Phe、異亮氨酸Lle、亮氨酸Leu、賴氨酸Lys)、澀味氨基酸(酪氨酸Tyr)。

料酒中自身含有多種氨基酸。其中不乏一些人體必需的氨基酸，例如甲硫氨酸、纈氨酸和亮氨酸等。由表5可知，添加蝦皮酶解物有利于增加料酒中呈味氨基酸的種類和含量。從氨基酸的種類來看，增加了半胱氨酸；從氨基酸的含量來看，游離氨基酸總量為4.345 g/L，較對照增加了517.19%。其中谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸和精氨酸等多種氨基酸的含量增加明顯，甜味和鮮味氨基酸含量之和與苦味和澀味氨基酸含量之和的比值相較于對照增加了101.18%，使得制備的料酒風味更加鮮美，既有料酒本身的酒香，又具有蝦皮的鮮香，兩者相得益彰。說明添加蝦皮酶解液進行料酒發酵可以增加料酒中氨基酸的含量并改善料酒的風味。

2.5 產品感官指標

2.5.1 外觀

橙黃色，清亮透明，有光澤，瓶底有微量聚集物。

2.5.2 香氣

具有黃酒特有的濃郁醇香和蝦皮的鮮香，無異香。

2.5.3 口味

醇和，鮮美，無異味。

2.5.4 風格

酒體協調，具有烹飪黃酒的典型風格。

3 結論

本文開發了一款新型調味料酒，在料酒發酵過程中添加蝦皮酶解液，制備得到的料酒中氨基酸態氮含量較高且游離氨基酸種類和含量豐富。蝦皮中含有大量的蛋白質和多種氨基酸，通過單因素試驗和正交試驗確定了蝦皮的最佳酶解條件，蝦皮在中性蛋白酶添加量800 U/g(蝦皮干重)、料液比1∶10 g/mL、50 ℃、pH 7.0條件下酶解2 h效果最佳，蝦皮酶解液中氨基酸態氮含量最高。傳統方法制備的料酒中氨基酸態氮主要來源于原料粳米中蛋白質分解和酵母等微生物的自溶。將蝦皮酶解液以輔料的形式添加到米醪中，增加了發酵環境中的氨基酸態氮含量，使得制備的料酒中氨基酸態氮和游離氨基酸含量大幅提高。蝦皮酶解液中含有蝦青素和多肽類物質，料酒的抗氧化能力還有待進一步研究。