SRAP分 子標記預測蘿卜遺傳距離與雜種優(yōu)勢的相關(guān)性

曾小玲，黃建都，謝鑫鑫，祝金虹

（1.福州市蔬菜科學研究所，福建 福州 350111；2.武夷山市土肥技術(shù)站，福建 武夷山 354300）

蘿卜（Raphanus sativusL.）又稱萊菔，十字花科蘿卜屬，是我國最主要的根菜類蔬菜。采用雜種優(yōu)勢選育出綜合性狀優(yōu)良的雜種一代是一種有效的育種手段。雜交育種通常是參照親本性狀的表現(xiàn)區(qū)別從而做出許多的組合配制，并且參照配合力而進行判斷，組合比較試驗可淘汰大部分的組合，選出少數(shù)優(yōu)勢強的組合，但常規(guī)育種方法受環(huán)境的影響大，人力物力耗費大，時間長，且效果很差。通過運用DNA分子標記親本間遺傳距離預測雜種優(yōu)勢的類似研究已經(jīng)在玉米等多種作物[1-10]上進行，這將成為一種有效的育種手段之一。相關(guān)序列擴增多態(tài)性（SRAP）標記具有操作簡單、多態(tài)性高、重復性好等[11]特點，在不同作物[12-14]遺傳多樣性分析中被應用，包括應用于蘿卜的遺傳多樣性分析[15]、抽薹性狀的分析[16]和種質(zhì)資源指紋圖譜分析[17]。本研究應用SRAP標記技術(shù)和蘿卜產(chǎn)量性狀[18]表型數(shù)據(jù)，通過解析蘿卜親本間遺傳距離與雜交組合雜種優(yōu)勢的相關(guān)性，以尋找運用SRAP標記遺傳距離預測蘿卜雜種優(yōu)勢的可行性，為加快蘿卜雜交種選育提供參考。

表1 供試材料及來源

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為福州市蔬菜科學研究所蘿卜課題組育成的高代耐寒自交不親和系11份，其中母本5份，分別是4-2H-4-1、13-2H-1、6-2H-2、24-1-8、20-9-3-5，父本6份，分別是39-3H-1、40-2H-2、18-2-2H-2、57-10-3-1H、9-3-1H、31-1H-1-3，具體見表1。按照NCⅡ不完全雙列雜交設計，組配成1套包括11個親本和30個F1的2個世代的材料。

1.2 田間試驗設計

2015年10月中旬直播于長樂市石壁村試驗地，包括11個親本、30個組合、白龍春（CK）共42個材料，隨機區(qū)組設計，3次重復，小區(qū)面積1.2 m×3.5 m，常規(guī)栽培管理。收獲期，每小區(qū)隨機取樣10株進行考種，考查根長、株高、葉片數(shù)、外露長、葉片長、葉片質(zhì)量6個農(nóng)藝性狀。

1.3 SRAP標記檢測

1.3.1 基因組DNA的提取

采用CTAB提取法提取蘿卜總DNA。取4片真葉時的蘿卜嫩葉0.2 g，放入研缽中，加液氮迅速研磨成細末后，快速移入已經(jīng)預熱的含2×CTAB 600 μL、β-巰基乙醇5 μL提取緩沖液的1.5 mL離心管中，充分混勻，65 ℃溫浴15 min；常溫下12 000 r/min離心10 min；取上清600 μL，加入等體積的酚︰氯仿︰異戊醇混勻，4 ℃、12 000 r/min離心5 min；取上清，加入2倍體積無水乙醇，-20 ℃靜置30 min；4 ℃、12 000 r/min離心10 min析出DNA沉淀，去上清；用70%乙醇，將DNA懸浮洗滌；4 ℃、8 000 r/min離心5 min，棄上清，吹干后將DNA溶解于ddH2O中，置于-20 ℃保存。

1.3.2 SRAP的PCR擴增與檢測

SRAP引物參照Zhang等[19]的報道，由生工生物（上海）股份有限公司合成。其中的1 3條正向引物以及1 6條反向引物依次為：me1～me13/em1～em16，2種不同的引物共組合成208個引物對。SRAP-PCR擴增體系為20 μL：30 ng模板DNA，2 μL的10×Buffer，0.4 μL的10 mmol/L dNTP，5 μmol/L的正反向引物各1 μL，0.2 μL的Taq，補水至20 μL。擴增程序參照繆體云等[20]的方法并稍作修改：94 ℃預變性3.5 min；94 ℃變性30 s，35 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，5個循環(huán)；94 ℃變性30 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR的擴增產(chǎn)物在1.8%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳緩沖液為1×TAE。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 親本間分子遺傳距離

根據(jù)PCR擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果，在電泳圖譜上將同一引物對、同一位點有DNA擴增帶記為1，同一位置上無帶記為0，形成0，1矩陣。

通過NTSYS 2.1統(tǒng)計分析軟件計算任意2個材料間的遺傳相似系數(shù)（GS）與遺傳距離（GD），計算公式為GS=2Nab/（Na+Nb），GD=1－GS；公式中，Nab代表材料a與b共有的擴增條帶總數(shù)，Na、Nb依次代表材料a和b中顯示的擴增條帶數(shù)量。

1.4.2 雜種優(yōu)勢

用常規(guī)考種方法，測定田間親本與雜種一代的根長、株高、葉片數(shù)、展開度、葉片長、根粗等農(nóng)藝性狀，從而計算出雜種優(yōu)勢。雜種優(yōu)勢計算方法為：中親優(yōu)勢=（F值－雙親平均值）/雙親平均值×100%；高親優(yōu)勢=（F值－高親值）/高親值×100%；公式中，F(xiàn)值代表主要產(chǎn)量相關(guān)農(nóng)藝性狀平均值，即將每個組合的優(yōu)勢累加和除總組合數(shù)；雙親平均值代表雙親同一性狀平均值；高親值代表高值親本同一性狀平均值。將雙親SRAP標記分子遺傳距離與F值、中親優(yōu)勢和高親優(yōu)勢值進行相關(guān)分析，用分子標記遺傳距離預測F1的產(chǎn)量性狀表現(xiàn)以及雜種優(yōu)勢的強弱。以上試驗結(jié)果的計算與分析在DPS 7.05與Excel軟件上進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘿卜主要農(nóng)藝性狀的遺傳變異

通過對11個親本中的6個產(chǎn)量相關(guān)性狀進行遺傳變異分析（表2），其中供試親本6個農(nóng)藝性狀的F值（平均值）均達到了極顯著水平，這說明供試的11個親本在6個農(nóng)藝性狀上彼此間都存在極顯著的遺傳差異。通過變異系數(shù)大小又不難發(fā)現(xiàn)，供試親本間葉片長度與葉片質(zhì)量的變異最明顯，變異系數(shù)分別為0.31與0.34；而株高的變異最小，變異系數(shù)為0.16。表明多數(shù)形態(tài)性狀上存在顯著或極顯著差異。

2.2 SRAP分子標記多態(tài)性比較

選擇208對SRAP引物組合分別對11個親本進行PCR擴增，結(jié)果從中分別篩選出親本間含多態(tài)性的SRAP引物共53對。53對SRAP多態(tài)性引物一共擴增出896條清晰條帶，然而每對引物組合產(chǎn)生5～29條擴增帶，平均有14.2條，呈現(xiàn)出多態(tài)性的譜帶數(shù)目共有327條，該數(shù)量占總條帶數(shù)的36.5%；其中，每1對引物組合都產(chǎn)生1～15條多態(tài)性帶，平均為5.2條，相當于平均檢測到5.2個等位基因。

2.3 SRAP標記估算的親本間遺傳距離比較

通過觀察SRAP標記結(jié)果，分別估算11個親本間的遺傳距離GD（表3）。其中，SRAP標記顯示的供試親本間遺傳距離變異范圍為0.162～0.486，其中57-10-3-1H與13-2H-1之間的遺傳距離最遠，為0.486，表明這2個材料親緣關(guān)系較遠；而4-2H-4-1、40-2H-2和18-2-2H-2這三者兩兩之間的遺傳距離最近，均為0.162，表明這3個材料間親緣關(guān)系較近；參試親本間的平均遺傳距離為0.291，表明供試親本之間遺傳基礎(chǔ)狹窄，遺傳差異不明顯，親緣關(guān)系較近，組配出強優(yōu)勢組合的概率較低。

2.4 F1農(nóng)藝性狀雜種優(yōu)勢表現(xiàn)

通過計算F1主要農(nóng)藝性狀的中親優(yōu)勢和高親優(yōu)勢的變幅和平均值可獲知（表4），葉片數(shù)的中親優(yōu)勢最大，30個組合的中親優(yōu)勢的平均值為12.11%，變幅為－10.57%～39.27%，中親優(yōu)勢表現(xiàn)為正向優(yōu)勢的組合數(shù)占50.00%；高親優(yōu)勢平均值為1.91%，變幅為－21.57%～26.27%，高親優(yōu)勢表現(xiàn)為正向優(yōu)勢的組合數(shù)占33.33%。其次，中親優(yōu)勢較大的性狀是株高、外露長和根長，其30個組合的中親優(yōu)勢平均值分別是10.76%、8.17%和8.03%，變幅分別是－11.26%～49.24%、－7.48%～28.16%和－20.68%～40.56%，中親優(yōu)勢表現(xiàn)為正向優(yōu)勢的組合數(shù)分別占60.00%、60.00%和53.33%；高親優(yōu)勢平均值分別為3.50%、－2.55%和0.76%，變幅分別是－21.45%～30.21%、－15.89%～13.25%和－33.25%～31.24%，高親優(yōu)勢表現(xiàn)正向優(yōu)勢的組合數(shù)分別占43.33%、40.00%和43.33%，株高的高親優(yōu)勢最大。葉片長與葉片質(zhì)量的雜種優(yōu)勢都較小，其30個組合的中親優(yōu)勢平均值分別為3.68%與1.61%，變幅分別為－4.61%～17.38%和－2.03%～18.58%，中親優(yōu)勢表現(xiàn)為正向優(yōu)勢的組合數(shù)分別占63.33%和43.33%；高親優(yōu)勢平均值分別為－2.65%和－1.95%，變幅分別為－11.74%～5.34%和－9.88%～10.87%，高親優(yōu)勢表現(xiàn)為正向優(yōu)勢的組合數(shù)分別占36.67%和30.00%。綜合中親優(yōu)勢和高親優(yōu)勢結(jié)果來看，株高的雜種優(yōu)勢最大，其次是葉片數(shù)和根長，說明在蘿卜親本的篩選中應優(yōu)先考慮的指標是株高，其次是葉片數(shù)和根長指標。

表2 親本主要農(nóng)藝性狀遺傳變異

表3 11個親本間的SRAP標記遺傳距離（GD）

表4 F1主要產(chǎn)量相關(guān)性狀雜種優(yōu)勢

表5 SRAP標記估算的遺傳距離和F1雜種優(yōu)勢的相關(guān)系數(shù)

2.5 SRAP標記估算的遺傳距離與農(nóng)藝性狀雜種優(yōu)勢的關(guān)系

將雙親分子遺傳距離、Fl雜種表現(xiàn)和農(nóng)藝性狀雜種優(yōu)勢間的相關(guān)性進行分析（表5），分子遺傳距離與F1雜種表現(xiàn)的相關(guān)分析表明：分子遺傳距離與株高之間達顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.41，與其他5個農(nóng)藝性狀的相關(guān)系數(shù)都不顯著。分子遺傳距離與各農(nóng)藝性狀的中親優(yōu)勢相關(guān)分析表明：分子遺傳距離與株高、根長和葉片數(shù)間達顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r分別為0.44、0.44、0.41，與外露長、葉片長和葉片質(zhì)量間相關(guān)系數(shù)均不顯著。與各農(nóng)藝性狀的高親優(yōu)勢相關(guān)分析表明：分子遺傳距離與株高間達極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.48，與根長和葉片數(shù)間均達顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r分別為0.43和0.38，分子遺傳距離與外露長、葉片長和葉片質(zhì)量間相關(guān)系數(shù)均不顯著。

3 討論

3.1 蘿卜主要農(nóng)藝性狀的雜種優(yōu)勢

利用SRAP分子標記進行蘿卜遺傳多樣性的分析已有報道，周娜[16]通過UPGMA聚類分析，將32份蘿卜分為4大類，和傳統(tǒng)的系譜分類一致。劉哲等[17]運用群體分離分析法從而篩選出SRAP引物組合，擴增出了和晚抽薹蘿卜基因緊密連鎖的多態(tài)性片段LB，從而成功做到了分子標記輔助育種，并且通過這種方式降低了蘿卜選育過程中對表型性狀的依賴，大大提升了蘿卜育種的效率。本試驗結(jié)果和前人的研究結(jié)果都證明，運用SRAP分子標記技術(shù)可有效地分析蘿卜材料的遺傳多樣性，實現(xiàn)快速劃分與利用雜種優(yōu)勢群。F1不同產(chǎn)量相關(guān)性狀的中親優(yōu)勢變幅為1.61%～12.11%，高親優(yōu)勢變幅為－2.65%～3.50%，說明了因為農(nóng)藝性狀與雜交組合的不同，蘿卜的農(nóng)藝性狀雜種優(yōu)勢大小有很大的差別，其中，既存在表現(xiàn)雜種優(yōu)勢大的性狀與組合，也存在表現(xiàn)小的性狀與組合。

3.2 SRAP分子標記預測雜種優(yōu)勢的可能性

遺傳距離是衡量品種間多個性狀綜合遺傳差異大小的指標，植物育種實踐已經(jīng)檢驗并且承認了其客觀性，雙親的基因型差異越大，雜種優(yōu)勢越強[21]。由于DNA分子標記技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的研究者嘗試使用許多不同的分子標記技術(shù)對不同作物的遺傳距離和雜種優(yōu)勢之間的相關(guān)性進行研究，并且獲得了不同的結(jié)論。Lee等[22]和Smith等[23]研究表明，分子標記遺傳距離和雜種優(yōu)勢之間呈現(xiàn)出極顯著正相關(guān)；而廖伏明等[24]和張濤等[25]的研究卻表明分子標記遺傳距離與F1雜種優(yōu)勢之間并沒有明顯的相關(guān)性，不能將其用于雜種優(yōu)勢的預測。

本研究結(jié)果表明，6個主要農(nóng)藝相關(guān)性狀雜種優(yōu)勢中株高的中親優(yōu)勢較大，高親優(yōu)勢最大，其次是葉片數(shù)、根長；在相同的SRAP標記的遺傳距離和雜種優(yōu)勢的相關(guān)系數(shù)中，遺傳距離和株高的F1雜種的表現(xiàn)、中親優(yōu)勢和高親優(yōu)勢的相關(guān)系數(shù)都呈顯著相關(guān)或極顯著相關(guān)水平，遺傳距離與葉片數(shù)、根長的中親優(yōu)勢和高親優(yōu)勢的相關(guān)系數(shù)都呈顯著相關(guān)水平；說明在蘿卜親本的篩選中應先考慮株高，其次是葉片數(shù)、根長，這樣才有可能在高密度直播種植模式下組配出雜種優(yōu)勢強的產(chǎn)量相關(guān)性狀的組合而實現(xiàn)高產(chǎn)。另一方面，SRAP標記的遺傳距離與F1雜種表現(xiàn)既有顯著相關(guān)，也有不顯著相關(guān)；與各主要農(nóng)藝性狀雜種優(yōu)勢相關(guān)達到極顯著、顯著相關(guān)或不顯著相關(guān)水平，顯著或極顯著相關(guān)系數(shù)介于0.38～0.48，表明SRAP分子標記遺傳距離在一定程度上能反映出農(nóng)藝性狀雜種優(yōu)勢的強弱，但是其相關(guān)程度還不能夠準確地預測雜種優(yōu)勢。

通過試驗發(fā)現(xiàn)，SRAP遺傳距離和農(nóng)藝性狀雜種優(yōu)勢與F1雜種表現(xiàn)的關(guān)系比較復雜。SRAP分子標記遺傳距離雖然能反映材料間的遺傳差異，但是SRAP分子標記是覆蓋在整個基因組上的，其雙親間的遺傳距離是親本全部位點上的差異，這涉及了大量和研究目標性狀無關(guān)的位點，使用它來分析分子遺傳距離和雜種優(yōu)勢的相關(guān)性時將存在誤差；然而，通過運用與雜種優(yōu)勢相關(guān)的QTL連鎖的標記位點來分析親本間的遺傳差異與雜種優(yōu)勢的相關(guān)性則更加具有準確性。張濤等[6]通過運用和產(chǎn)量性狀相關(guān)的功能基因標記分析了雜交水稻組合親本間的遺傳差異，從而研究了標記遺傳距離和產(chǎn)量雜種優(yōu)勢的相關(guān)性，結(jié)果表明兩者呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，這可以證明功能基因標記可以運用于雜交水稻雜種優(yōu)勢預測，但最終結(jié)果將依賴于雜種優(yōu)勢遺傳機理的闡明。