刺槐揮發性物質分析及美國白蛾的觸角電位反應

白鵬華 相偉芳 劉寶生 李敏 于金萍

摘要：為開發美國白蛾（Hyphantria curea Drury）植物源驅避劑，本研究采用水蒸氣蒸餾法收集美國白蛾非寄主植物刺槐葉片的揮發性化學物質并進行觸角電位活性測定。氣相色譜-質譜（GC-MS）分析測定結果顯示刺槐揮發物共有16種，正二十七烷含量（19.72%）最高，其次依次是正二十五烷（12.36%）、植物醇（10.41%）、正二十三烷（10.39%）、α-亞麻酸（7.93%）和棕櫚酸（6.70%）。美國白蛾雌蛾和雄蛾對烷烴類化合物正二十七烷、正二十五烷和正二十三烷的反應較弱，對植物醇、亞麻酸和棕櫚酸反應相對強烈。雄蛾對濃度為10-1（V/V）的亞麻酸反應最強，EAG反應值為1.69，其次是濃度為10-3（V/V）的植物醇，EAG反應值為1.48；雌蛾對濃度為10-2 mg/mL的棕櫚酸反應最強，EAG反應值為1.93，其次是濃度為10-4（V/V）的植物醇和10-4 mg/mL的棕櫚酸，EAG反應值分別為1.90和1.63。

關鍵詞：美國白蛾；刺槐；揮發性物質；觸角電位

中圖分類號：S433.4文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2018）05-0103-06

Abstract To explore plant repellent of Hyphantria cunea Drury， the steam distillation method was used to collect the green leaf volatiles in the non-host plant Robinta pseudoacacia， and the electrophysiological responses of Hyphantria cunea to the volatiles were determined through EAG technique. The results showed that a total of 16 compounds were identified from Robinta pseudoacacia leave by GC-MS. The amount of heptacosane was the highest （19.72%） in the volatiles， followed by pentacosane （12.36%）， phytol （10.41%）， tricosane （10.39%）， α-linolenic acid （7.93%） and palmitic acid （6.70%）. The electroantennogram analyses indicated that the adults of H. cunea showed stronger EAG responses to phyto， α-linolenic acid and palmitic acid than heptacosane， pentacosane and tricosane. The males H. cunea showed the strongest EAG response to α-linolenic acid at the concentration of 10-1（V/V） and the value EAG was 1.69， followed by 10-3（V/V） of phytol with the EAG value as 1.48. The female H. cunea showed the strongest EAG response to palmitic acid at the concentration of 10-2 mg/mL with the EAG value as 1.93， followed by 10-4（V/V） of phytol and 10-4 mg/mL of palmitic acid with the EAG values as 1.90 and 1.63， respectively.

Keywords Hyphantria cunea Drury； Robinta pseudoacacia； Volatiles； Electroantennogram

近年來化肥、農藥等投入品的大量使用造成了農產品質量安全問題日益普遍和農藥化肥污染事件頻發，阻礙了環境友好型農業的發展進程。因此，農業部提出“公共植保、綠色植保”的植保理念，以農業生產、農產品質量和農業生態環境安全為目標，采取生態調控等環境友好型技術控制農作物病蟲害[1]。隨著化學生態學研究的深入，植物揮發物的使用已成為在害蟲綜合治理中主要的化學信息調控策略[2]。通過探明各揮發物的功能，利用這些揮發物可進行害蟲防治，如引誘劑、驅避劑的研發。

非寄主揮發物的化學物質組分對害蟲的取食、產卵的趨避作用是“推-拉”式防治策略中的重要基礎之一，具有良好的應用前景，是國內植物保護研究的熱點之一。李思翰等[3]研究表明非寄主植物棉花苗釋放的揮發物對蝗蝻產生趨避作用；邢亞等[4]研究表明1 mol/L非寄主植物揮發物橙花醇和香柏油對楊干象雌蟲具有較強的驅避作用，驅避率高達81.5%和78.75%；馬艷粉等[5]研究表明非寄主植物滇楊揮發物丁香酚在12 mg/L時對馬鈴薯塊莖蛾產卵趨避率為62.1%。了解害蟲取食與產卵對寄主選擇的行為，可以為制定害蟲“推-拉”式等生態控制策略提供理論基礎。

重大外來入侵害蟲——美國白蛾屬鱗翅目燈蛾科，是一種多食性檢驗檢疫性害蟲，可危害636種植物，在我國寄主植物達300多種[6， 7]。國內研究表明美國白蛾主要危害桑樹、臭椿、白蠟，喜食的寄主植物有榆樹、山楂、蘋果、梨等，厭食的樹種有刺槐、香椿、銀杏、國槐、杜仲、苦楝、龍柏等[8， 9]。美國白蛾是否能夠識別寄主植物和非寄主植物化學信號，從而造成選擇性差異？因此，探索美國白蛾與寄主植物、非寄主植物之間化學通訊很有必要。Tang 等[10， 11]鑒定出喜食寄主植物桑樹葉片揮發物成分中有11種對美國白蛾成蟲具有觸角電位活性，分別是己烯醛、正-3-己烯醛、檸檬烯、反-2-己烯醛、環己酮、正-2-戊烯-1-醇、甲基戊烯酮、二丙酮醇、反-3-己烯-1-醇、β-羅勒烯、2， 4-二甲基-3-戊烯醇，其中β-羅勒烯能夠增加雄蛾對性信息素誘餌的吸引力。然而，有關美國白蛾與非寄主植物揮發物反應的研究尚未見報道。

寄主化學信息物質在植食性昆蟲的寄主定位過程中的作用非常重要，而觸角作為接收植物化學信號的嗅覺器官，對昆蟲定位寄主植物、尋找配偶和產卵場所起著重要的作用[12]。昆蟲觸角電位儀（EAG）用于鑒定昆蟲對植物揮發性物質的電生理反應，通過 EAG 反應值的大小來判斷揮發性物質對昆蟲是否有活性。

為探明美國白蛾非寄主植物揮發物與其化學通訊之間的交互作用，通過GC-MS方法鑒定出美國白蛾非寄主植物刺槐揮發物成分，并且通過電生理試驗驗證這些化合物對美國白蛾成蟲是否具有觸角電位活性，為研制和開發驅避劑、開展美國白蛾的綜合防控及生態調控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 刺槐葉片揮發性物質分析

1.1.1 提取方法 刺槐葉片于2016年6月采自天津市西青區大柳灘村。采用水蒸氣蒸餾法進行提取：將新鮮的刺槐葉片用水沖洗干凈，剪碎，準確稱取1 000 g放入水蒸氣精油提取設備中，在蒸餾瓶中加入蒸餾水，水面沒過葉片為宜，持續蒸餾4 h。用正己烷對蒸餾物進行萃取，采用分液漏斗分液，保留含有揮發物質的上層液體并用無水硫酸鈉去除多余的水分，再用旋轉蒸發儀去除正己烷，最終獲得淡黃色精油。用正己烷稀釋精油，進行GC-MS分析。

1.1.2 樣品分析條件 氣相色譜采用Agilent 6890N（Santa Clara，CA，USA），質譜為5973MD。使用HP-5MS柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）進行分析。加熱程序起始溫度為60℃，保持1 min，然后以10℃/min的速率上升到180℃，保持1 min，再以20℃/min的速率上升到280℃，保持15 min。進樣口的溫度設為270℃。1 μL精油用100 μL丙酮稀釋進樣，1∶10分流比，柱中流速為1.0 mL/min。掃描質量范圍50～550 m/z，速度為2 scans/s。

1.2 美國白蛾對刺槐葉片揮發性物質的觸角電位反應

1.2.1 試驗昆蟲 于2016年7月在天津市農業科學院武清創新基地楊樹上采集美國白蛾幼蟲，室內飼養至蛹，光照周期為16 h 光照/8 h黑暗，溫度為（25±1）°C。羽化1—3日齡的未交配成蟲用于觸角電生理反應測試。

1.2.2 觸角電位反應測試化合物 選擇刺槐葉揮發物中含量較高的6種化合物（正二十七烷、正二十五烷、植物醇、正二十三烷、α-亞麻酸和棕櫚酸）用于EAG試驗。測試的化合物標準品來源見表1，植物醇和α-亞麻酸用液體石蠟進行稀釋，按照體積比設置5個濃度梯度，分別為1、10-1、10-2、10-3、10-4 （V/V），石蠟作為對照。固體試劑正二十七烷、正二十五烷、正二十三烷和棕櫚酸用正己烷稀釋，配置成1、10-1、10-2、10-3、10-4 mg/mL，正己烷作為對照。

1.2.3 觸角電位測試方法 用鋒利的刀片將美國白蛾觸角從基部切下并將其尖端切除少許后，用導電膠將其橫搭在電極上，氣味混合管與觸角相距1 cm，以液體石蠟（正己烷）為對照。連續氣體流量300 mL/min，刺激氣體流量20 mL/min。取刺激樣品10 μL滴于濾紙條（2 cm × 2 cm）上，管口一端連接刺激氣體控制裝置，另一端插入氣味混合管上的側孔，待基線穩定后用腳踏板人為給予刺激，每次刺激時間為0.1 s，兩次刺激間隔時間為1 min，以使觸角狀態恢復。

刺激化合物的每一個濃度前后各測一次參照化合物即標準品溶劑的反應值。每根觸角重復4次，每個處理重復4根不同的觸角。樣品的觸角電位反應值按照以下公式進行校正，以消除溶劑帶來的影響。

式中，RC為測試樣品的觸角電位反應值；RC-1為測試樣品前空白對照的觸角電位反應值；RC+1為測試樣品后空白對照的觸角電位反應值。

數據采用SPSS 17.0進行統計分析，Turkey法進行差異顯著分析。

2 結果與分析

2.1 刺槐葉片揮發性物質GC-MS總離子流圖

通過水蒸氣蒸餾法利用GC-MS對非寄主植物刺槐葉片揮發物成分進行分析，獲得其總離子流圖（圖1），扣除雜質峰，共分離得到16個有效峰，可以認為此16個峰幾乎代表了自然狀態刺槐葉片的揮發物。

2.2 刺槐葉片揮發性物質GC-MS分析

采用儀器自帶譜庫，運用計算機檢索，結合人工解析各個峰對應的質譜圖，從刺槐葉片氣味中共鑒定出16種化合物（表2）。相對含量超過10%的有4種，占總含量的52.88%，分別是正二十七烷（19.72%）、正二十五烷（12.36%）、植物醇（10.41%）和正二十三烷（10.39%）；相對含量超過5%的有2種，占總含量的14.63%，分別是α-亞麻酸（7.93%）和棕櫚酸（6.70%）。

2.3 美國白蛾對刺槐葉片揮發物的觸角電位反應

美國白蛾雄成蟲對正二十七烷沒有強烈的反應；雌成蟲的反應整體趨勢呈倒“V”字型，隨著濃度的增加EAG相對反應值增加，當濃度達到10-3 mg/mL時反應值（1.11）達到最高，之后隨著濃度的增加反應值降低（圖2）。雄成蟲對正二十五烷高濃度具有觸角電位活性，在高濃度（1和10-1 mg/mL）反應值分別為1.08和1.05；而雌成蟲隨著濃度的變化，EAG反應值上下波動，各個濃度之間無顯著差異。雄成蟲對正二十三烷的反應隨著濃度的增加反應值呈現波動變化，當濃度為10-2 mg/mL時反應值最大（1.34），顯著高于其余濃度的反應值；雌成蟲對正二十三烷沒有反應，EAG反應值均低于1。

美國白蛾雄成蟲對植物醇5個濃度的EAG反應較強烈，但各個濃度之間無顯著差異，在濃度為10-3（V/V）時反應值（1.48）最高；雌成蟲對植物醇的EAG反應值隨著濃度的增加反應值整體呈下降趨勢，在濃度為10-4（V/V）時反應值（1.90）最高，且顯著高于其它4個濃度的反應值。

雄成蟲對亞麻酸的EAG反應值隨著濃度的增加而增加，當濃度為10-1（V/V）時反應值（1.69）最高，且顯著高于其它4個濃度的EAG反應值；雌成蟲對亞麻酸的反應值低于雄成蟲，5個濃度之間沒有顯著性差異。

雄成蟲對棕櫚酸的EAG反應值隨著濃度的增加先增加隨后降低，在濃度為10-2 mg/mL時反應值最大（1.14），但各個濃度之間無顯著性差異；雌成蟲對不同濃度棕櫚酸的EAG反應值差異較大，在濃度為10-2 mg/mL時反應值最大（1.93），其次是濃度為10-4 mg/mL時反應值（1.63），二者顯著高于其它3個濃度的EAG反應值。

3 討論與結論

植物揮發性物質在植物與植食性昆蟲之間的化學通訊中起決定性作用，參與調控寄主定向飛行、取食、交配和產卵場所的選擇等行為。每種植物都會釋放出其特有的揮發性氣味物質，這些物質組成的混合物構成了植物特有的揮發性氣味物質的化學指紋圖譜。本研究通過GC-MS方法，鑒定出美國白蛾非寄主植物刺槐葉片揮發物成分及相對含量，其中正二十七烷含量（19.72%）最高，其次依次是正二十五烷（12.36%）、植物醇（10.41%）、正二十三烷（10.39%）、α-亞麻酸（7.93%）和棕櫚酸（6.70%），該結果與薛皎亮等[13]報道的刺槐枝葉揮發性物質組成差異較大，可能由于揮發物收集方法不同和品種差異造成的。烷烴類化合物在刺槐葉片中大量存在，含量高達49%，本研究結果與前人結果一致，烷烴類化合物在白蠟、山核桃、黃山欒樹、野薔薇、垂絲海棠、甘藍等植物揮發物中普遍存在[14-16]。

本研究表明正二十七烷、正二十五烷和正二十三烷在刺槐揮發物中含量較高，而美國白蛾雌、雄成蟲對烷烴類化合物的EAG反應值較低（0.81～1.15），但正二十三烷在濃度為10-2 mg/mL時雄成蟲的反應值為1.34。蔣興川等[17]報道甘藍和玉米揮發物中的二十七烷和二十九烷對亞洲玉米螟初孵幼蟲具有引誘活性，張文輝等[18]報道正二十七烷可能與水稻對白背飛虱的抗性有關。因此，烷烴類化合物（如正二十三烷）對美國白蛾雄成蟲是否具有引誘或趨避功能需要進一步驗證。

有報道表明植物醇濃度為10-2（V/V）時對普通大薊馬有顯著的引誘活性[19]，美國白蛾成蟲對低濃度植物醇反應敏感程度高，雄成蟲在10-3（V/V）時EAG反應值最大（1.48），雌成蟲在10-4（V/V）時反應值（1.90）顯著高于其它處理濃度的反應值。李玲等[20]研究表明棕櫚酸對青楊脊虎天牛雌蟲反應敏感程度高于雄蟲，本研究結果與其一致，這反映了美國白蛾雌蟲和雄蟲觸角感受器類型不同或存在嗅覺生理方面的定性差異[21]。當棕櫚酸濃度為10-2 mg/mL和10-4 mg/mL時雌成蟲反應值分別為1.93和1.63，顯著高于其余濃度反應值。因此，本試驗結果表明同一化合物不同濃度對昆蟲觸角電位活性存在差異，與前人研究結果一致[22]。

將非寄主揮發物作為驅避劑與寄主揮發物或者性信息素結合應用的“推-拉”策略要優于單純用引誘劑的效果，可提升對美國白蛾的防控效果。本研究表明美國白蛾雌蛾和雄蛾對植物醇、亞麻酸和棕櫚酸的觸角電位反應強烈，這3種化合物對美國白蛾是否具有驅避作用或引誘作用仍需做進一步的行為測定。篩選出行為活性最強的單劑及最佳混合配比，可以為美國白蛾綠色防控提供理論依據和技術支撐。

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