玉米Mutator轉座子系統的應用及展望

高志勇 謝恒星 李吉鋒 劉史力

摘要：轉座子標簽法是近年來發展起來的一種非常有效的分子生物技術，是一種利用TEs插入高等植物基因組中造成基因突變，然后通過分離TEs插入的旁鄰序列，克隆出突變基因的策略。這種策略在高等植物的功能基因組學研究中十分有用。玉米轉座子系統主要有En/Spm系統、Ac/Ds系統和Mutator系統三大類。其中Mutator轉座子易于插入到基因內部及基因周圍，引起的正向突變頻率為10-5～10-4，比野生玉米高出近30倍，所引起的突變大部分為隱性突變。由Mutator轉座子引起的突變，可以通過TAIL-PCR的方法，對相關的突變基因進行克隆。當前通過這種方法，已經克隆出一些重要的基因。本文主要介紹了Mutator轉座子的應用，并對Mutator轉座子系統的研究前景進行了展望。

關鍵詞：玉米；Mutator轉座子；應用；展望

中圖分類號：S513.035.3文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2018）05-0168-05

Abstract The transposon tagging is a very effective molecular biology technology developed in recent years. It causes gene mutation through TEs insertion into the genomes of higher plants， and then the mutanted genes can be cloned by isolating the flanking sequence of TEs. This strategy is very useful in the study of the functional genomics of higher plants. The main systems of maize transposon are En/Spm， Ac/Ds and Mutator ones. Among them， the Mutator transposon was prone to inserting within or around the gene； the positive mutation frequency was 10-5～10-4， which was nearly 30 times higher than that of the wild corn； and most of the mutations were recessive. The mutation can also be cloned by TAIL-PCR. Now by this method， some important genes have been cloned. In this paper， we mainly introduced the application of Mutator system， and discussed the research prospect of Mutator transposon system.

Keywords Maize； Mutator transposon； Application； Prospect

1951年，McClintock發現了玉米中的控制元件，后被命名為轉座元件或轉座子（transposon），在化學本質上，轉座子是基因組中的一段DNA序列[1]。隨后，細菌、酵母、高等動植物中的轉座元件也陸續被發現。基因組中的轉座子能從其原位點上復制或斷裂下來，通過環化，插入其他位點[2]。轉座子的發現大大推進了分子生物學的發展。了解轉座子的結構，有助于解析生物遺傳進化的具體機制，為生物學研究提供更加方便的工具。

玉米中的轉座子系統有三大類，即En/Spm系統[3]、Ac/Ds系統[4]和Mutator（Mu）系統[5]，其中誘變能力最高的是Mu轉座子系統[6]。Mu轉座子可插入到基因的內部及周圍，多引起隱性突變[7]。通過TAIL-PCR可以克隆出相應的突變基因。1984年，采用轉座子標簽法，分離出了玉米的bronze基因，此后，通過這種方法，克隆出了更多基因。基因組內的Mu轉座子，一般有較多的拷貝，所引起的突變常發生在非連鎖區域，引起表型突變。由于Mu轉座子的特有性質和用途，使其成為目前分子生物學研究的一個重要焦點[8]。在反向遺傳學的研究中，Mu轉座子起到了重要的作用[9]。

在三大糧食作物（玉米、水稻、小麥）中，玉米年產量最高，現為世界第一大農作物[10]。它不僅是重要的糧食和飼料作物，還是重要的食品工業原料和能源植物[11]。玉米的生產，在維護世界糧食安全和全球經濟穩定發展中，都占有重要的地位[12]。分子生物學技術的快速發展，推進完成了玉米基因組序列測序，相應地推進了玉米功能基因組學研究，以及玉米種質資源創制和分子育種研究。在基因功能的研究中，突變體是最直接有效的材料[13]，而在創制玉米突變體庫中，Mu轉座子系統發揮著重要的作用。

1 Mu轉座子的分類及特征

1.1 Mu轉座子的分類

Mu轉座子家族包括兩個大類，即自主型的MuDR因子和非自主型因子。根據Mu插入片段內部序列的特異性，可把Mu插入片段分為6個亞族，即Mu1/Mu2、Mu3、Mu4、Mu6/Mu7、Mu8、MuDR/Mu5[6]。這其中，把早先命名的MuA2、MuR1、Mu9和Cy統一劃歸為MuDR亞族，它們自身能編碼發生轉座所需要的蛋白質；非自主型因子主要有Mu1/Mu2、Mu3、Mu4、Mu6/Mu7和Mu8，這一類因子不能自主轉座，只有在MuDR同時存在時，才能發生轉座。非自主型因子會因為自主型因子的存在而變得不穩定。后續的研究中，在2002年，Charles等又發現了3種Mu因子，包括Mu10、Mu11和Mu12[14]；2011年，Tan等在玉米的UniformMu家系中，發現了轉座因子Mu13[8]，這是一種具有活性的轉座因子。

1.2 Mu轉座子活性

Mu轉座子發生轉座的頻率很高[15]，可以發生在體細胞和生殖細胞。如果在體細胞中發生轉座子切除和插入，突變就可在當代發生，容易發生回復突變，不可遺傳；而如果在前減數分裂細胞和配子中發生轉座，則回復突變的發生頻率就相對較低，通常能遺傳。因此，在評估Mu轉座子的活性時，一般要根據其家系與自交系的雜交后代進行自交后，用所出現的突變數量進行衡量。統計時，對質量性狀突變，統計數據比較準確；而對于數量性狀突變，環境因素的影響較大，使得統計結果可靠性較低[16]。

1.3 Mu插入位點特征

Mu雖然能在任何品系的基因組中引起插入突變，但不同的遺傳背景會影響Mu因子的轉座，并且在不同的基因中，突變頻率可相差8倍以上[17]。Mu轉座子插入在基因組中有著一定的偏好性，可插入到啟動子、5′非轉錄區、外顯子和內含子中。Mu轉座子插入的靶位點序列，是轉座酶識別并發生錯切的特異序列[18]。通常情況下，Mu轉座子插入對近5′末端的轉錄起始位點有最強的偏好性[18]。

2 Mu轉座子標簽插入位點側翼序列的獲得方法

2.1 熱不對稱交錯PCR

對已知序列的側翼序列進行擴增時，一般采用熱不對稱交錯PCR（thermal asymmetric interlaced PCR， TAIL-PCR）方法。TAIL-PCR方法是一種染色體步移技術，首先運用在分離黏粒（P1）載體和酵母人工染色體插入片段末端序列，后用于轉座子插入位點側翼序列的測定。在TAIL-PCR中，利用嵌套的3個特異性引物，分別同簡并引物組合，進行連續的PCR循環，采取不同的退火溫度，選擇性地擴增出目標片段，所得到的擴增片段，可直接用作測序模板或探針標記。試驗過程中，首先根據DNA的已知序列，設計3條特異引物（special primer，SP），要求SP要同向且退火溫度較高，結合退火溫度較低的簡并引物（可以設計多條，AP1、AP2、AP3……），進行熱不對稱的PCR 反應。一般情況下，簡并引物至少要有一種，能利用退火溫度的差異，同特異性引物之間進行熱不對稱的PCR 反應。通常經過3次巢式 PCR 反應后，便可得到已知序列的側翼序列。在一次試驗中所獲得的擴增產物的長度，如果滿足不了試驗的要求，可以再依據第一次步移所獲得的序列信息，接著進行側翼序列的擴增[19]。

2.2 MuTAIL-PCR

根據Mu轉座子的TIR序列，Settles等[20]進行了特異性巢式引物的設計，通過優化TAIL-PCR，提出了MuTAIL-PCR的方法，可以對Mu因子插入靶位點側翼序列進行專一性擴增。MuTAIL-PCR方法簡單，程序較少，應用方便。其流程原理圖[21]如圖1。

劉文婷等[21]利用優化的MuTAIL-PCR 技術，擴增出105 條序列，經生物信息學分析，其中的99 條為Mu轉座子的側翼序列，陽性率達到94.2%，這個結果顯示，利用MuTAIL-PCR技術，可有效地擴增出Mu轉座子插入位點的側翼序列。

3 Mu轉座子系統的應用

Mu轉座子具有較高的正向突變率，傾向于插入基因富含區和低拷貝的序列區，因而從發現Mu轉座子開始，其在玉米功能基因組學的研究中，顯示出越來越廣泛的應用[22]。

3.1 誘發基因突變

插入到功能基因附近或內部的因子，都有可能改變基因的功能，引起可見表型的基因突變。在相對較少的群體內，Mu轉座子可以誘發覆蓋全基因組的大量突變體。因為Mu轉座子具有比較保守的TIR，所以可以根據TIR 進行PCR 引物的設計，對Mu轉座子誘發的插入突變群體進行高效的檢測[23]。Mu轉座子可插入到基因的任何區域，包括啟動子、內含子、外顯子等區域，引起基因的表達、蛋白質結構發生改變，最終影響其功能[14]。由于Mu轉座子的這些特征，使得其有效地用于創建玉米突變體庫和進行突變基因分離。

通過Mu轉座子介導，已成功地創建了玉米突變體庫[24]。已使用過的構建玉米突變體庫的方法中，有物理、化學、農桿菌介導的T-DNA和轉座子插入突變等多種方法[25]，從所得的試驗結果來看， Mu轉座子具有較高的誘變頻率、低插入位點偏愛性和基因組內拷貝數多等特點。對所獲得的Mu轉座子誘導的突變體，要進行Mu轉座子插入位點側翼序列的生物信息學分析，方能預測突變基因功能。當前，有多種分離Mu轉座子插入側翼序列的方法[26]，常用的有PCR步移技術、反向PCR技術[27]、TAIL-PCR技術、AFLP技術[28]等。

有研究者應用Mu轉座子系統，成功地構建了許多玉米突變體庫[29]。1995年，美國先鋒公司將Mu轉座子第一個應用其中，成功地構建了玉米性狀利用系統（trait utility system for corn， TUSC），并篩選出了幾百個由Mu轉座子插入引起的突變體。May等[30]公開征集了含Mu轉座子的40 000 個玉米家系，構建了玉米定向誘變數據庫（maize targeted mutagenesis database， MTMdB）。Fernandes等[17]利用基因工程化的RescueMu，將其轉移到玉米品系中后，通過和Mu品系進行雜交，使Mu因子發生轉座，得到了RescueMu序列數據庫。在含有Mu轉座子的W22 回交群體（UniformMu）中，McCarty等[31]通過DNA微陣列方法，篩選出了2 000 多個籽粒突變品系。國內的研究中，引進了具有活性Mu轉座子的材料作為供體，與本地優良玉米自交系受體進行雜交，獲得了大型插入誘變M1群體[21]。采用田間突變型鑒定、室內籽粒性狀考察等方法，評價了Mu轉座子的轉座頻率，并利用優化的MuTAIL-PCR技術[20]擴增、克隆、測序、生物信息學分析靶位點側翼序列，構建了我國第一個玉米Mu轉座子介導的插入突變體庫。通過一個新的不依賴組織培養的玉米轉基因技術體系，利用農桿菌介導的玉米合子轉化方法，獲得了轉基因植株及后代。雌穗平均結實率為39%，合子轉化頻率達1%以上，并且轉化的基因可以遺傳[32]。

3.2 基因克隆及功能研究的標簽

轉座子標簽法是篩選由于基因內發生轉座子插入而導致突變表型的一種研究方法。利用分子生物學技術，對包含轉座子的突變基因進行確定，再應用突變基因的部分序列，進行探針制備，用于分子雜交，把該基因的剩余片段從基因組文庫中篩選出來，對其進行全序列測定。獲得的基因全序列，一方面要對序列進行生物信息學分析，以獲得基因的結構和可能的理論生物學功能；另一方面對序列進行載體構建及遺傳轉化，鑒定出該基因的實際生物學功能。

通過Mu突變體庫已經成功分離克隆了諸多基因[17]。在利用Mu突變體庫篩選甜玉米突變體的研究中，加速了甜玉米新種質的創制，并推進了對玉米胚乳發育與淀粉合成機制的認識[33]。陳果等[34]利用Mu轉座子鑒定了5個響應干旱脅迫的玉米蛋白磷酸酶基因；新近的研究，對玉米ZmCIPK23基因Mu插入突變體進行了有效鑒定[35]。

4 Mu轉座子系統研究展望

在Mu轉座子的研究中，發現自主性轉座因子MuDR有著重大的意義，圍繞MuDR 因子，今后還需要進一步開展一系列的系統研究工作，涉及到Mu轉座子高頻轉座的機理，以及MuDR的表觀遺傳機理等。Mu轉座子可以進行體細胞插入、共抑制，還具有較低的回復突變頻率，這些都增加了Mu轉座子系統研究的復雜性，要有效地進行這些研究工作，必須有創造性的思維。研究Mu因子同其寄主在進化過程中的相互關系，也有著重大的意義。利用轉基因的方法，將Mu因子直接導入異源植物中，是一個困難重重但意義遠大的課題，如果可以把活性Mu因子進行轉化，那么Mu因子就可以作為有效的工具，應用于其它異源物種的基因誘變，構建異源物種的Mu轉座子插入突變體庫，開展基因分離等研究工作。對轉座活性抑制位點Muk促使MuDR產生沉默的機制，特別在基因轉錄水平上，需要進行更深入的探討。所有這些研究成果，必將對分子生物學的發展起到巨大的促進作用[36]。

當前，擬南芥和水稻的基因組草圖已構建成功，玉米基因組的測序也已完成[37]。面對這些大量的植物基因組序列信息，揭示各基因的具體功能意義重大[38]。要充分利用Mu因子的存在廣泛、拷貝數高等優勢，使Mu因子標簽法在分離克隆植物基因的研究中發揮出更加有效的作用。到目前為止，Mu轉座子是已發現的轉座活性最高、誘變能力最強的植物轉座因子，雖然對其轉座的調控機理還知道的較少，但在進行玉米插入誘變、分離克隆基因中，Mu轉座子已成為重要的研究方法。伴隨著分子生物學的快速發展及對Mu轉座子特征和作用機理的深入研究，Mu因子系統必將在功能基因組學研究上展示出更大的作用。

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