響應面法優化超聲波輔助木瓜蛋白酶嫩化牛肉

王清波 張慜 楊朝暉

摘要：采用超聲波輔助木瓜蛋白酶的方式對生牛肉進行嫩化，探究酶用量、處理溫度、超聲波功率和超聲波時間對牛肉剪切力和感官評分的影響，最終以酶用量、處理溫度和超聲波功率為嫩化因素，以剪切力為響應值，運用響應曲面法對嫩化牛肉的工藝參數進行優化。結果表明，超聲波輔助木瓜蛋白酶嫩化牛肉的最優工藝參數為：酶用量16 U/g，處理溫度51℃，超聲波功率151 W，超聲波時間20 min，此條件下嫩化得到的牛肉剪切力值為3 887.21 g，與對照組（7 629.16 g）相比降低49.0%，試驗值與預測值較為吻合。采用超聲波輔助木瓜蛋白酶嫩化牛肉，一定程度上可以減少酶的用量，縮短嫩化時間，同時又能保證良好的嫩化效果。

關鍵詞：牛肉；超聲波；木瓜蛋白酶；嫩化；響應面優化

中圖分類號：S879.2：TS251.5+2文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2018）05-0136-07

Abstract In this paper， we tenderized the beef using papain combined with ultrasonic to study the effect of enzyme dosage， treatment temperature， ultrasonic power and time on the shear force and sensory evaluation of the beef. Finally， with enzyme dosage， treatment temperature and ultrasonic power as the factors and shear force as the response variable， the tenderization conditions were optimized by response surface methodology. The results showed that the optimal conditions for tenderization of beef by papain combined with ultrasonic were obtained as follows： enzyme dosage at 16 U/g， treatment temperature at 51℃， ultrasonic power at 151 W， and ultrasonic time as 20 minutes. The actual shear force of beef under the optimal conditions was 3 887.21 g， which reduced significantly compared with the control （7 629.16 g） by 49%. The actual value was basically consistent with the predicted values of the model. Papain combined with ultrasonic could not only guarantee nice tenderization effect on beef， but also partly reduce the enzyme dosage and the treatment time.

Keywords Beef； Ultrasonic； Papain； Tenderization； Response surface optimization

嫩度是評價肉類品質的最重要因素之一，它極大地影響了消費者的可接受性[1]。肉質嫩化的主要機理是肌肉組織中的肌動球蛋白、膠原蛋白和彈性蛋白發生水解，結締組織遭到破壞，被分解成無定形的小塊[2]。近年來，食品科學研究者一直在探尋能有效改善肉類品質的嫩化方法[3]。目前國內外應用于肉制品加工工業的嫩化方法主要分為物理法（高壓處理、超聲波法、滾揉法等）、化學法（鈣鹽處理、磷酸鹽注射、添加淀粉[4]等）和生物嫩化法（外源酶嫩化處理，包括木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶、菠蘿蛋白酶等）[1]。

作為一種有效的嫩化方法，酶嫩化已經在肉品加工工業中應用了多年。外源酶如菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、豬胰酶等已被廣泛地用作肉嫩化劑[5]。由木瓜乳膠中提取而來的木瓜蛋白酶是工業肉嫩化中最常見的一種植物酶，因為它可以破壞肉的肌纖維蛋白和結締組織[6]。研究表明，木瓜蛋白酶不僅能有效提高肉的嫩度，還可以在不產生不良風味的同時甚至能更好地改善其風味。夏軍軍等[7]以剪切力為響應指標，采用響應面法優化了木瓜蛋白酶嫩化牛腿肉的工藝。朱建等[8]采用正交試驗優化得到了木瓜蛋白酶處理羊肉的最優嫩化條件。 Gerelt[5]、Ionescu[1]和Whitehurst[9]等均探討了牛肉經過木瓜蛋白酶處理后的肌纖維斷裂和嫩度改善情況。然而，酶嫩化面臨著一個普遍問題，即如何使酶在物料內部的分布更均衡，作用效率更高。另外，酶活性的變化是影響結果的重要因素，若用量稍多可能就會使得水解過度，造成肉質老化、持水性下降、口感及風味變差等問題[10]。

超聲波是指頻率高于20 kHz的機械波[11]。超聲波可以誘導和壓迫細胞結構從而產生微小氣泡，這種現象稱為空化效應，其高能量的傳播會在組織內部引起強烈反應，造成肉內部結構的損壞，從而達到一定的嫩化效果[3， 12]。超聲波用于肉質嫩化時可引起物理性的組織蛋白酶和鈣離子的釋放，從而破壞肌肉組織[13]。Dickens等[14]研究了低頻率超聲波（40 kHz，15 min）對肉雞胸肌的影響，發現可改善熟制后雞胸肉的嫩度和質構屬性。楊性民等[15]通過正交試驗發現超聲波聯合木瓜蛋白酶對蝦干的嫩化效果優于CaCl2和復合磷酸鹽聯合超聲波。短時低強度的超聲波處理還能夠提高某些酶自身的活性。黃六容等[16]研究發現在一定的超聲波功率下，木瓜蛋白酶活性隨時間延長呈現先增高后下降的趨勢。另外，超聲波還被作為主要或輔助手段用于豬肉片[17]、牛肉[18]、魷魚[19]、羊肉[20]等的嫩化。

綜上，無論是單一木瓜蛋白酶處理，還是單獨超聲波處理，均可對肉類達到一定的嫩化效果。同時，超聲波對木瓜蛋白酶的性質有一定的積極影響，而目前超聲波輔助木瓜蛋白酶對肉類嫩化效果方面的研究較少。因此，本研究采用響應面優化法，用超聲波輔助木瓜蛋白酶對牛肉進行嫩化，以評價肉類嫩化效果廣泛采用的剪切力作為評價指標，考察處理溫度、木瓜蛋白酶用量、超聲波時間、超聲波功率對牛肉嫩化效果的影響，優化其工藝參數，以期為肉制品的嫩化提供更多的研究思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料

冷凍生牛肉（-18℃以下配送，產地阿根廷，品種安格斯牛，取自腹部，瘦肉部分與非瘦肉部分平均質量比例為4∶1）；木瓜蛋白酶（10萬 U/g），廣州華琪生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

TA-XT2i型物性測試儀，英國 Stable Microsystems公司；DZQ型真空包裝機，上海市尤溪機械設備有限公司；HH-S 型水浴鍋，鄭州市長城科技工貿有限公司；10001型電子天平，常州宏衡電子儀器廠；帶有恒溫設備的超聲波設備（頻率20 kHz），寧波市新芝生物科技股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 牛肉嫩化處理方法 用pH 7.0的磷酸鹽緩沖液配制不同濃度的木瓜蛋白酶溶液，4℃冷藏保存，待用。

將牛肉從冷凍室取出，在0～4℃條件下解凍24 h至中心溫度達到0℃以上，順牛肉的肌纖維方向切成3 cm×6 cm×6 cm的肉塊[21]，用濾紙吸干表面水分，采用10 mL注射器吸取10 mL酶液，對瘦肉部分進行均勻注射，盡量保證酶液在肉塊中分布均勻，然后將肉塊轉移至13 cm×19 cm的耐高溫蒸煮袋中并進行真空封口，置于水面以下進行超聲波處理后取出，放入80℃水浴鍋中水浴加熱，當牛肉中心溫度達到70℃時開始計時，30 min后取出并冷卻至室溫[7]。

1.3.2 感官評定 參考唐福元[22]、李培紅[23]以及周珠法[24]等的評價方法。選擇接受過專業訓練的人員成立10人感官評定小組，對樣品進行感官評價。采用九點評分法，從色澤、氣味、形態和口感四個方面對樣品進行評分， 每一項指標進行評分后按照其所占權重進行加和得到最終感官評分，其中，每一項指標所占權重分別為色澤20%、氣味20%、形態20%、口感40%。

1.3.3 剪切力的測定 將嫩化處理后的樣品瘦肉部分順肌纖維方向切成長方體小塊，與肌纖維平行的方向為長，取2 cm，寬和高均為1 cm。每組切取十個樣品作為平行，使用TA-XT2i質構儀進行剪切力測定。選擇HDP/BSK探頭，設置測定參數如下：測前、測中及測后速度均為2.00 mm/s，壓縮距離40 mm，平行測定十次，取平均值。

1.3.4 單因素試驗 按參考文獻[24， 25]進行預試驗后，將pH設為固定值7.0，以處理溫度、酶用量、超聲波時間、超聲波功率為影響因素進行單因素試驗，考察各因素對嫩化后牛肉剪切力和感官評分影響。

固定酶用量15 U/g，超聲波時間30 min，超聲波功率150 W，考察不同處理溫度（30、40、50、60、70℃）對牛肉剪切力和感官評分的影響。

固定處理溫度50℃，超聲波時間30 min，超聲波功率150 W，考察不同酶用量（5、10、15、20、25 U/g）對牛肉剪切力和感官評分的影響。

固定處理溫度50℃，酶用量15 U/g ，超聲波功率150 W，考察不同超聲波時間（10、20、30、40、50 min）對牛肉剪切力和感官評分的影響。

固定處理溫度50℃，酶用量15 U/g，超聲波時間30 min，考察不同超聲波功率（50、100、150、200、250 W）對牛肉剪切力和感官評分的影響。

1.3.5 響應面優化試驗設計 在單因素試驗結果的基礎上，運用Box-Behnken中心試驗設計原理，篩選木瓜蛋白酶用量、處理溫度和超聲波功率三個變量作為影響牛肉嫩度的主要因素，以剪切力作為相應值，進行三因素三水平響應面設計試驗。響應面因素設計如表2，超聲波時間設置為20 min。

1.3.6 牛肉微觀結構的倒置熒光顯微鏡觀察 設3個處理：（a）未處理；（b）酶用量16 U/g，51℃水浴，20 min嫩化處理；（c）酶用量16 U/g，51℃水浴，超聲波功率151 W，超聲波時間20 min嫩化處理。將3組樣品的瘦肉部分分別沿肌纖維的縱切面和垂直于肌纖維的橫切面進行冷凍切片，厚度為8.0 mm，置于倒置熒光顯微鏡下進行微觀結構觀察，考察單獨酶嫩化處理以及超聲波輔助酶嫩化處理對牛肉瘦肉部分微觀結構的影響。

1.3.7 數據分析 利用SPSS 19.0軟件對試驗結果進行方差分析和顯著性檢驗，多重比較采用Duncans法，P<0.05表示差異顯著。響應曲面設計及數據分析采用Design-expert 8.0.6軟件進行。采用Origin 8.5進行作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 木瓜蛋白酶用量對牛肉嫩化效果的影響 由圖1可知，當酶用量逐漸增加時，牛肉的剪切力呈下降趨勢，尤其是在酶用量為5～20 U/g 的范圍內，剪切力下降速率比較快，當酶用量大于20 U/g時，剪切力變化趨于平緩，沒有顯著性差異。而牛肉的感官評分隨酶用量增大呈現先增加后降低的趨勢，原因是當酶用量增大到15 U/g時剪切力為3 882.34 g，與對照組（7 629.16 g）相比降低了49.1%，此時硬度有一定的改善，口感等正合適，感官評分達到最高值8.27，而當剪切力繼續降低時牛肉的組織結構會由于過度嫩化而導致色澤變差、口感過軟等問題，感官評分降低。這與周珠法[24]的研究結果一致。綜合剪切力值和感官評分兩個指標，選擇木瓜蛋白酶的最佳用量為15 U/g。

2.1.2 處理溫度對牛肉嫩化效果的影響 由圖2可知，當處理溫度在30～50℃時，牛肉剪切力隨溫度的升高呈迅速下降趨勢，感官評分則逐漸升高，當溫度為50℃時剪切力達到最低值3 863.85 g，這與王晶等[26]的研究結果比較一致，此時牛肉的感官評分最高，為8.36；而當溫度高于50℃后，剪切力隨溫度的增加而逐漸增大。因為溫度過高，超過了木瓜蛋白酶作用的最適溫度，酶開始變性失活。由于剪切力增加，牛肉的嫩度下降，咀嚼性、硬度等較差，感官評分逐漸降低。故選擇50℃為最佳處理溫度。

2.1.3 超聲波功率對牛肉嫩化效果的影響 由圖3可知，當超聲波功率逐漸變大時，牛肉的剪切力呈先下降后上升的變化趨勢，在150 W時達到最低值3 940.53 g，此趨勢與唐福元等[22]的研究結果相似。黃六容等[16]研究發現，在低功率超聲波（0～300 W）作用條件下，木瓜蛋白酶活性隨超聲波功率的增加呈現先上升后下降的趨勢，超聲波功率為40 W時酶活性達到最大，而超聲波功率過高時會破壞酶的結構，使其活性下降甚至徹底失活。本研究中超聲波功率為150 W時嫩化效果最好，與其超聲波40 W時木瓜蛋白酶活性最大不太一致。可能是因為本研究是將酶注射到牛肉中進行反應的，而不是直接將酶暴露在超聲波的作用中，肉對酶可能具有一定的保護作用。感官評分在功率150 W時也達到最大值8.13，故選擇150 W作為最佳超聲波功率進行以下試驗。

2.1.4 超聲波時間對牛肉嫩化效果的影響 由圖4可知，牛肉剪切力隨超聲波時間增加而逐漸降低，感官評分逐漸升高，但是當超聲波時間大于20 min時，剪切力和感官評分的變化均無顯著性差異（P>0.05）。夏軍軍等[7]運用響應面法對酶嫩化牛肉的工藝進行優化時發現，影響剪切力因素的主次順序為：溫度>酶用量>時間。趙立等[4]采用響應面法優化超聲波嫩化鴨肉工藝時發現，影響鴨肉嫩度因素的主次順序為：溫度>超聲波功率>超聲波時間，且超聲波時間對剪切力沒有顯著性影響（P>0.05）。因此，以下進行響應面設計時將超聲波時間設為20 min。

2.2 響應面優化試驗結果分析

2.2.1 響應面試驗設計及結果 由單因素試驗結果可以發現，牛肉的剪切力值和感官評分的變化趨勢相關。當剪切力值最小時，感官評分一般是最高的；而當剪切力值較大時，感官評分一般比較低。因此，采用能通過試驗比較精確得到的剪切力值作為相應值進行響應面優化試驗，優化試驗結果見表3。

2.2.2 回歸模型的建立及方差分析 通過Design-expert 8.0.6軟件對剪切力和各因素進行逐步回歸擬合，得到超聲波輔助木瓜蛋白酶嫩化牛肉工藝中剪切力（Y）與酶用量（A）、處理溫度（B）和超聲波功率（C）三個因素之間的多元二次回歸方程，如下：

Y=3950.99-202.10A-91.42B-38.91C+27.05AB+26.62AC+53.53BC+486.30A2+415.50B2+464.93C2

由表4可以看出，回歸模型P<0.0001，說明構建的預測模型極顯著。失擬項P>0.05，差異不顯著，說明該方程能較好地描述各嫩化條件與牛肉剪切力之間的關系。該模型的R2=0.9563，表明此模型能夠解釋響應面中95.63%的可變性，可用于優化牛肉嫩化條件。由F值大小可以得到影響剪切力的各因素主次順序為：酶用量（A）>處理溫度（B）>超聲波功率（C），其中一次項因素中A、B對剪切力影響極顯著（P<0.01），C對剪切力影響顯著（P<0.05），交互項中BC對剪切力影響顯著（P<0.05），平方項中A2、B2、C2對剪切力的影響均為極顯著（P<0.01）。

2.2.3 響應面中各因素間交互作用分析 根據以上得到的回歸方程，使用Design-expert 8.0.6 軟件對表4中的數據進行多元回歸擬合，得到各因素交互效應的響應面圖及等高線，如圖5所示。剪切力由等高線的中心區域向邊緣區域逐漸增大，中心區域剪切力最大。BC交互作用響應面的凹陷程度大于AB和AC交互作用，表明BC交互作用對剪切力的影響更大。這與上述方差分析的結果是一致的，即當酶用量為15 U/g、超聲波時間為20 min時，處理溫度和超聲波功率的交互效應對牛肉的剪切力值有顯著影響（P<0.05），而其他的交互效應影響不顯著（P>0.05）。整體來說，當其中兩個因素為固定值時，變量因素均呈現先降低后升高的趨勢。

2.2.4 最優工藝參數的確定及驗證 通過Design-expert 8.0.6 軟件分析，得到優化后的最佳工藝參數為：酶用量16.02 U/g，處理溫度51.01℃，超聲波功率151.47 W，超聲波時間20 min，此條件下嫩化的牛肉剪切力為3 925.14 g。為了操作方便，將實際的最佳工藝參數調整為：酶用量16 U/g，處理溫度51℃，超聲波功率151 W，超聲波時間20 min。利用此條件嫩化牛肉進行驗證試驗，得到的牛肉剪切力值為3 887.21 g，與模型預測值接近，與未嫩化處理組（7 629.16 g）相比剪切力降低了49.0%，與不加超聲波而其他條件相同的單獨酶嫩化處理組（4 663.42 g）相比降低了16.6%，均具有顯著性差異（P<0.05）。證明該優化后的實際工藝條件可靠合理。

2.2.5 嫩化對牛肉微觀結構的影響 圖6比較了未嫩化處理、酶嫩化處理以及超聲波輔助酶嫩化處理三組牛肉瘦肉部分橫切面和縱切面在倒置熒光顯微鏡下的微觀結構。由縱切面圖（A）可以看出，未嫩化處理的牛肉肌纖維結構完整，而經過嫩化處理的牛肉肌纖維結構斷裂明顯，且超聲波輔助木瓜蛋白酶嫩化的牛肉比單獨使用木瓜蛋白酶嫩化的牛肉肌纖維結構斷裂的片段更小且比較均勻，證明超聲波輔助木瓜蛋白酶對牛肉的嫩化效果更均勻。由橫切面圖可以看出，未嫩化處理的牛肉肌纖維束之間的結構比較致密，中間比較大的不均勻空洞可能是因為冷凍切片時對牛肉的結構造成了一定破壞而出現的，而嫩化處理后的牛肉肌肉纖維結構變得比較疏松，肌纖維之間出現了很多間隙，密度變小，且超聲波輔助木瓜蛋白酶處理的樣品比木瓜蛋白酶單獨處理的樣品間隙更多更大，而且更均勻，這與縱切面的結果是一致的。

3 結論

本試驗通過單因素試驗和響應面法對超聲波輔助木瓜蛋白酶嫩化牛肉的條件進行優化，得到的響應面模型效果極顯著（P<0.01）。由回歸方程確定的最佳工藝參數為：木瓜蛋白酶用量16.02 U/g，處理溫度51.01℃，超聲波功率151.47 W，超聲波時間20 min，考慮到實際操作條件將最佳工藝參數修正為酶用量16 U/g，處理溫度51℃，超聲波功率151 W，超聲波時間20 min。最佳工藝參數下嫩化得到的牛肉剪切力值為3 887.21 g，與模型預測值3 925.14 g相近，表明模型比較可靠。其與對照組（7 629.16 g）相比剪切力降低49.0%，與不加超聲波而其他條件相同的單獨酶嫩化處理組（4 663.42 g）相比降低了16.6%，均具有顯著性差異（P<0.05）。另外結合牛肉瘦肉部分橫切面和縱切面的微觀結構觀察，可知超聲波確實具有嫩化牛肉的效果，且輔助酶嫩化時可以提高整體的均勻性，同時此工藝在一定程度上減少了酶用量，縮短了嫩化時間，可以為肉制品的嫩化工藝提供一定的參考和依據。

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