不同濃度DAPT對(duì)體外培養(yǎng)的糖尿病大鼠動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞增殖影響的研究

范東旭，劉彥東*，薛金枝，王瀚銳，程明勛，金 松

（1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.大慶市第四醫(yī)院，黑龍江 大慶 163712）

隨著糖尿病患者在血管外科患者中所占比例逐漸增加，引起血管外科醫(yī)生高度重視，對(duì)糖尿病患者血管再生的研究成為熱點(diǎn)，相關(guān)研究證明，Notch信號(hào)通路能促進(jìn)非糖尿病動(dòng)物缺血區(qū)的血管新生、動(dòng)靜脈分化等，本課題應(yīng)用不同濃度的γ-分泌酶抑制劑（DAPT）對(duì)Notch信號(hào)通路的關(guān)鍵酶γ-分泌酶進(jìn)行抑制，探尋適宜血管再生的濃度，為進(jìn)一步研究DM下肢缺血區(qū)血管新生提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 組織來(lái)源

已完成鑒定凍存的糖尿病大鼠血管平滑肌細(xì)胞。

1.2 試劑

0.25%胰酶細(xì)胞消化液 invitrogen 公司，TRYPSIN 0.25%EDTA（25200056 Life），D-PBS （sh30028.01B Hyclone），D-Hank’s液（不含Ca、Mg）（sh30030.03B Hyclone），γ-分泌酶抑制劑（DAPT）（美國(guó)Sigma公司），細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（MTT BB-4201貝博生物）。

1.3 培養(yǎng)基

在DMEM培養(yǎng)液（Gibco BRL，USA）培養(yǎng)基中添加15%胎牛血清（南美）（sv30087.02 Hyclone）、1%青霉素、1%鏈霉素，200目篩，一次性過(guò)濾除菌器除菌備用（4周內(nèi)用完）。

1.4 器械及儀器

T25培養(yǎng)瓶，倒置顯微鏡，細(xì)胞計(jì)數(shù)板、超凈工作臺(tái)，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板Corning Inc等。

2 方 法

2.1 細(xì)胞復(fù)蘇及傳代[1-2]

從液氮罐中取冷凍管，迅速放入38℃水浴中，并不時(shí)搖動(dòng)，使其1 min內(nèi)完全融化，

然后在超凈工作臺(tái)中打開(kāi)凍存管，用吸管將細(xì)胞懸液注入離心管中，滴加10ml 培養(yǎng)液；

然后1000 r/min離心5 min，棄上清，加入適量培養(yǎng)液后接種于培養(yǎng)瓶中，接種濃度1*10g/L，置37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日更換養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)情況，若細(xì)胞在80%～90%融合時(shí)即可細(xì)胞傳代，以后根據(jù)情況在長(zhǎng)滿1～2天后開(kāi)始傳代；所有操作均在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行，將細(xì)胞懸液按1：2傳代培養(yǎng)，加入培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞后，置37℃、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d換培養(yǎng)液一次，傳代至第3代時(shí)可進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)。

2.2 MTT實(shí)驗(yàn)[3]

用0.25%胰蛋白酶消化并收集DM大鼠VSMCs，計(jì)數(shù)細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液。以2.0×104/ml、200 μl/孔接種于96孔板上，加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。將γ-分泌酶抑制劑DAPT儲(chǔ)存溶液倍比稀釋為工作液終濃度分別為0.15、0.30、0.45、0.6、0.75、1.25、2.5、5、7.5、10、20 μmol/L，對(duì)照組不加，按濃度于96孔板上設(shè)置12排/板，共設(shè)置10個(gè)板；分別于0、12、24、48、72小時(shí)取出96孔板，每孔加入5 mg/ml MTT 20μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)上清；每孔加入150 μl DMSO：無(wú)水乙醇=1：1的混合液震蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解；在酶標(biāo)儀上，以波長(zhǎng)570 nm測(cè)定各孔光密度（Optical density，OD）值；以（OD測(cè)定孔-OD空白孔）表示每組的實(shí)際OD值；以正常對(duì)照組的細(xì)胞活力為100%，各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞活力=OD實(shí)驗(yàn)組的實(shí)際值/OD對(duì)照組的實(shí)際值。

3 結(jié) 果

與對(duì)照組相比，不同濃度的DAPT（0.15、0.30、0.45、0.60、0.75、1.25、2.50、5.00、7.50、10.00、20.00μmol/L）對(duì)DM大鼠VSMCs有抑制作用，這種抑制作用在0.15～7.50μmol/L濃度之間呈時(shí)間-濃度依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），7.50μmol/L濃度以上無(wú)明顯變化，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；根據(jù)作用曲線，各時(shí)間段DAPT對(duì)DM大鼠VSMCs細(xì)胞的半抑制率大約出現(xiàn)在0.15 μmol/L和2.50 μmol/L，且72小時(shí)時(shí)對(duì)DM大鼠VSMCs細(xì)胞的半抑制率較其余各時(shí)間段明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

4 討 論

糖尿病血管并發(fā)癥是糖尿病患者主要致殘、致死原因[4]。流行病學(xué)調(diào)查研究表明，糖尿病患者發(fā)生心腦血管并發(fā)癥的危險(xiǎn)性較正常人增加34倍，血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）是動(dòng)脈壁的主要組成成分，在糖尿病血管并發(fā)癥的動(dòng)脈粥樣硬化形成中起著關(guān)鍵作用，因此對(duì)VSMC 的研究有著重要的意義。相關(guān)研究證明：Notch信號(hào)通路能促進(jìn)非糖尿病動(dòng)物缺血區(qū)的血管新生、動(dòng)靜脈分化等；本課題證明題DAPT對(duì)DM大鼠VSMCs有抑制作用，這種抑制作用在0.15～7.50μmol/L濃度之間呈時(shí)間-濃度依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），7.50 μmol/L濃度以上無(wú)明顯變化，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；根據(jù)作用曲線，各時(shí)間段DAPT對(duì)DM大鼠VSMCs細(xì)胞的半抑制率大約出現(xiàn)在0.15 μmol/L和2.50 μmol/L，且72小時(shí)時(shí)對(duì)DM大鼠VSMCs細(xì)胞的半抑制率較其余各時(shí)間段明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。證明Notch信號(hào)通路通過(guò)受體、配體、下游信號(hào)等各種蛋白共同作用下，在一定程度上可促進(jìn)糖尿病患者下肢缺血區(qū)的血管再生，隨著對(duì)Notch信號(hào)通路研究的深入和對(duì)血管新生影響機(jī)制的闡明以及促血管或抑制血管新生方法的不斷完善，一定能為相關(guān)血管疾病治療提供重要策略和新的靶點(diǎn)。